BAHAN DAN METODE
2. Penentuan Perkiraan Waktu Reaksi Terbaik untuk Gliserolisis
Penentuan perkiraan lama proses atau waktu reaksi gliserolisis yang relatif terbaik dilakukan untuk menghasilkan MDAG (mono- diasilgliserol) dengan rendemen yang tinggi, kadar MAG tinggi dan kadar TAG yang rendah. Hasil yang diperoleh kemudian digunakan dalam menentukan titik tengah perancangan optimasi reaksi gliserolisis.
Gambar 7 Diagram alir penentuan waktu reaksi terbaik pada proses gliserolisis untuk sintesis MDAG
Agitasi dengan rotary shaker selama 2,4,8,10,16,18,20,22 dan 24 jam dan suhu 60˚C
Heksan 5 ml
Lipase 10%
Pengenceran produk dengan pelarut heksan sebanyak 50 ml
Pemisahan produk dari enzim dan silika gel menggunakan sentrifuse (1000 rpm selama 5
menit)
Fraksinasi produk pada suhu 7˚C selama 16-18 jam
Pemisahan produk dari heksan dengan penyaringan MDAG Analisis MDAG +heksan Heksan Lipase +silika gel
RBDPO + Gliserol (telah dicampur silika gel)
Proses gliserolisis dilakukan pada substrat RBDPO dan gliserol sebanyak 5 g yang diagitasi dan dipanaskan sampai suhu 60˚C kemudian ditambahkan enzim lipase 10 % (w/w oil) dan pelarut heksan 5 ml. Lama proses gliserolisis yang dicobakan adalah 2, 4, 8, 10, 16, 18, 20, 22, dan 24 jam (Gambar 7), seluruh perlakuan diulang 2 kali sehingga diperlukan 18 sampel perlakuan. Lama proses yang relatif terbaik digunakan sebagai titik tengah dalam mencari kondisi optimum untuk sintesis MDAG.
Optimasi Reaksi Gliserolisis untuk Sintesis MDAG
Optimasi dilakukan untuk mencari kondisi optimum proses gliserolisis yang dapat menghasilkan MDAG dengan komposisi MAG dan DAG tinggi serta komposisi TAG rendah. Rancangan percobaan yang digunakan pada tahap ini mengikuti rancangan Central Composite Design (CCD) dari Respon Surface Methodology (RSM) dengan dua variabel yaitu waktu dan suhu reaksi gliserolisis. Interval variabel berupa perlakuan dan kode perlakuan dapat dilihat pada Tabel 4, sedangkan rancangan percobaan dapat dilihat pada Tabel 5 (Cochran and Cox 1962).
Tabel 4 Perlakuan dan kode perlakuan untuk optimasi proses gliserolisis Kode Perlakuan Perlakuan -1,414 -1 0 1 1,414 Waktu (jam) 16 17,17 20 22,83 24 Suhu (°C) 55 56,5 60 63,5 65
Contoh perhitungan penentuan nilai pada kode 1.
Nilai suhu pada kode 1 = 60oC + ⎟
⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ − ) 60 65 ( 414 , 1 1 x oC = 63,5oC
Tabel 5 Rancangan percobaan dengan sistem pengkodean
No. Suhu (°C) Waktu Reaksi (jam)
1 -1 -1 2 1 -1 3 -1 1 4 1 1 5 -1,414 0 6 1,414 0 7 0 -1,414 8 0 1,414 9 0 0 10 0 0 11 0 0 12 0 0 13 0 0
Sumber : Cochran and Cox (1962)
contoh kondisi suhu dan waktu reaksi pada perlakuan nomor 1 : waktu reaksi (-1) = 17,17 jam
suhu reaksi (-1) = 56,5oC
Rancangan Percobaan yang digunakan adalah Central Composite design. Model Respon surface digunakan untuk melihat pengaruh perlakuan waktu dan suhu reaksi terhadap redemen produk, serta komposisi MAG, DAG dan TAG dalam produk. Titik tengah perancangan penelitian diambil dari suhu dan waktu reaksi terpilih pada penelitian sebelumnya. Seluruh perlakuan terdiri dari 13 set percobaan, dimana model umum rancangan percobaan yang digunakan adalah :
ε β β β β + + + + =
∑ ∑ ∑
− = = = = k k j i k i i ii k i i i X X X Y , 1 2 j 1, i j i, 1 2 1 0 X Keterangan : Y = Respon pengamatan β0 = Intercept βi = Pengaruh linier βii = Pengaruh kuadratikβij = Pengaruh interaksi perlakuan Xi = Kode untuk faktor ke-i
Xj = Kode untuk faktor ke-j k = Jumlah faktor yang dicobakan
Data yang diperoleh kemudian dianalisis dengan software SAS v6.12 dan bentuk permukaan tanggap diperoleh dengan menggunakan software Surfer 32
Verifikasi Kondisi Optimum Proses Gliserolisis untuk Sintesis MDAG
Setelah diperoleh kondisi optimum dengan parameter-parameter diatas, kemudian dilakukan verifikasi dengan 5 ulangan dan dilakukan analisa sifat fisikokimia produk meliputi komposisi (analisa TLC), kadar asam lemak bebas (AOAC, 1995), bilangan iod dengan metode Wijs (AOAC, 1995), Titik leleh (AOAC, 1995) dan nilai HLB (AOAC, 1995).
Pengamatan Rendemen
Rendemen dihitung dari persentase bobot produk MDAG yang diperoleh dari hasil percobaan (g) dibandingkan dengan bobot produk secara teoritis yang diperoleh dari hasil perhitungan reaksi kimia pada lampiran 2.
Rendemen (%) = Bobot produk MDAG percobaan x 100% Bobot produk MDAG teoritis
Komposisi Gliserida (Metode TLC)
Sebanyak 0,05 g produk MDAG dilarutkan dalam 1 ml kloroform. Kemudian sebanyak 1 µl larutan diaplikasikan pada TLC plate dalam bentuk spot bulat (ditotol) dengan jarak antar spot (antar sampel) 2 cm. TLC plate kemudian dielusi menggunakan campuran pelarut petroleum eter : dietil eter : asam asetat glasial (70:30:0,2 v/v/v) yang telah dijenuhkan dalam chamber glass. Setelah elusi selesai dilakukan (sampai tanda batas atas pada TLC plate), plate dikeluarkan dari
chamber kemudian didiamkan beberapa menit sampai uap dari pelarut hilang. Identifikasi kemudian dilakukan dengan menyemprotkan larutan fluoresens seperti Rhodamine 6G atau 2’,7’-dichlorofluorescein pada TLC plate, sehingga fraksi-fraksi hasil pemisahan produk (MAG, DAG dan TAG) dapat
terbentuk kemudian diberi tanda dengan menggunakan pensil untuk memperjelas area fraksi-fraksi yang telah terpisah.
Gambar 8 TLC Plate
Pengukuran kadar MAG dilakukan secara kuantitatif dengan membandingkan luas area fraksi MAG dengan total fraksi yang terbentuk dari hasil elusi produk MDAG dalam TLC plate. Hal ini dilakukan dengan cara menggambar ulang fraksi-fraksi (spot) yang terbentuk dalam TLC plate diatas kertas kalkir, kemudian kertas-kertas ini digunting sesuai dengan area-area fraksi yang terbentuk, sehingga masing-masing guntingan ini bisa ditimbang. Hasil timbangan menunjukkan kuantitas masing-masing fraksi yang terkandung dalam produk MDAG.
Nilai fraksi MAG yang tebentuk dalam produk dihitung berdasarkan berat potongan kertas fraksi MAG dibagi berat potongan kertas total fraksi (MAG, DAG dan TAG) dikali 100%. Perhitungan nilai fraksi DAG dan TAG sama dengan perhitungan komposisi untuk fraksi MAG.
Kadar MAG (%) = Bobot kertas fraksi MAG (g) x 100% Bobot kertas seluruh fraksi (g)
Kadar DAG (%) = Bobot kertas fraksi DAG (g) x 100% Bobot kertas seluruh fraksi (g)
Fraksi MAG Fraksi DAG Fraksi TAG
Kadar TAG (%) = Bobot kertas fraksi TAG (g) x 100% Bobot kertas seluruh fraksi (g)
Bilangan Peroksida (AOAC 1995)
Contoh minyak ditimbang seberat 5 g dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer tertutup dan diisi dengan gas N2. sampel ditambah dengan 10 ml kloform dan distirer kemudian ditambah asam asetat glasial sebanyak 15 ml. Larutan KI jenuh ditambahkan sebanyak 1 ml kemudian ditutup dengan cepat, digoyang selama 1 menit. Sampel disimpan di tempat yang gelap selama 5 menit pada suhu 15oC sampai 25oC. Setelah itu, sampel ditambahkan 75 ml air destilata. Larutan tersebut dititrasi dengan larutan sodium thiosulfat 0,002N dan digoyang dengan kuat. Larutan pati yang digunakan sebagai indikator ditambahkan ketika warna kuning larutan hampir hilang dan titrasi diteruskan hingga warna biru menghilang. Titrasi juga dilakukan terhadap blangko.
BP = ( ) x1000
m xT Vb Vs−
Keterangan : BP = bilangan peroksida (meq O2/kg)
Vs = volume sodium thiosulfat untuk titrasi sampel (ml) Vb = volume sodium thiosulfat untuk titrasi blangko (ml) T = konsentrasi sodium thiosulfat yang distandarisasi m = massa sampel (g)
Kadar Asam Lemak Bebas (ALB) (AOAC 1995)
Sampel ditimbang sebanyak 5,6 g kemudian dilarutkan ke dalam 50 ml etanol (alkohol) 95%. Larutan ini kemudian ditrasi dengan NaOH 0,01N dengan indikator fenoftalein hingga terlihat warna merah muda selama 10 detik. Kadar asam lemak bebas dihitung dengan menggunakan rumus perhitungan :
Kadar Asam = m x M x T x V 10
Keterangan : V = volume (ml) KOH untuk titrasi T = normalitas larutan KOH
M = berat molekul sampel
m = jumlah sampel yang digunakan
Kadar Air dalam Minyak RBDPO (AOAC 1995)
Sampel RBDPO ditimbang sebanyak 5 g dalam cawan alumunium yang sebelumnya telah dikeringkan dalam oven bersuhu 105˚C dandiketahui beratnya. Sampel dimasukka kedalam oven selama 6 jam kemudian dipindahkan dalam desikator dan didinginkan. Setelah dingin kemudin cawan ditimbang kembali dan proses diulang sampai bobot cawan tetap. Kadar air dihitung dengan menggunakan perhitungan berikut
Kadar air (KA) = c- (a-b) x 100% c
dimana : a = berat cawan dan sampel b = berat cawan dan sampel akhir c = berat sampel awal
Bilangan Iod, Metode Wijs (AOAC 1995)
Sampel minyak yang telah disaring ditimbang sebanyak 0,5 g dalam labu erlenmenyer 500 ml, ditambahkan 20 ml larutan kloroform, 25 ml larutan Wijs kemudian dicampur merata dan disimpan dalam ruang tertutup selama 30 menit pada suhu 25OC. Selanjutnya ditambahkan 20 ml larutan KI 15% dan 100 ml aquades yang sudah dididihkan lalu dititrasi dengan larutan Na2S2O3 0,1 Normal sampai larutan berwarna kekuningan. Setelah itu ditambah indikator pati dan dititrasi kembali sampai warna biru hilang. Blanko dibuat dengan cara yang sama tanpa menggunakan minyak. Bilangan iod dinyatakan sebagai gram iod yang diserap per 100 gram sampel, dihitung sampai dua desimal.
Bilangan Iod = m V V xTx( 3 4) 69 , 12 −
Dimana: T = Normalitas larutan standard Na2S2O3 0.1 Normal V3 = Volume larutan titrasi untuk blanko (ml)
V4 = Volume larutan titrasi untuk sampel (ml) 12,69 = Bobot atom iod
Titik Leleh (Melting Point) (AOAC 1995)
Padatan MDAG dimasukkan ke dalam pipa kapiler setinggi 1 cm. Pipa kapiler tersebut dimasukkan dalam freezer selama 16 jam. Pipa kapiler dan termometer dicelupkan ke dalam 600 ml gelas piala yang berisi air destilata. Gelas piala dipanaskan dengan kenaikan suhu 0,5-1.0 0C/menit. Bila contoh mulai naik, termometer dibaca dan bila telah naik 4 cm dari semula suhu juga dibaca. Titik cair adalah rata-rata pembagian dari kedua pembacaan suhu tersebut.
Nilai HLB (AOAC 1995)
Penentuan nilai HLB produk M-DAG hasil pemisahan dilakukan dengan menggunakan metode kurva baku HLB melalui pengukuran nilai air. Pengemulsi yang telah diketahui nilai HLB-nya diambil sebanyak 1 g dan dilarutkan ke dalam 25 ml pelarut dari campuran DMF (dimetil formamida) dan benzena dengan perbandingan 20 : 1 (v/v). Larutan dititrasi dengan air destilata pada suhu larutan 20±1oC. Titrasi diakhiri setelah campuran menjadi keruh permanen. Hal yang sama juga dilakukan terhadap sampel M-DAG. Nilai air dihitung menggunakan persamaan : Nilai air = ) ( ) ( gram pengemulsi contoh bobot ml penitrasi air volume
Nilai air yang diperoleh dialurkan terhadap HLB pengemulsi, sehingga terbentuk kurva baku HLB yang digunakan untuk menentukan nilai HLB produk M-DAG. Penentuan nilai HLB pada penelitian ini menggunakan kurva baku (Tabel 6) dan grafik persamaan untuk memperoleh kurva standar nilai HLB (Gambar 9) yang dihasilkan dari penelitian Atmaja (2000). Kurva baku pada Gambar 9 menunjukan persamaan y = 0,1325 x - 0,0455 dimana y adalah nilai air dan x adalah nilai HLB.
Tabel 6 Kurva standard (nilai air vs HLB)
HLB
standar Berat (g) volume air (ml) nilai air
3 1,005 0,35 0,35 5 1,006 0,65 0,65 7 1,008 0,90 0,89 9 1,005 1,05 1,04 11 1,012 1,50 1,48 Sumber : Atmadja (2000) y = 0.1325x - 0.0455 R2 = 0.9761 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 0 2 4 6 8 10 12 Nilai HLB N ila i A ir
Persamaan Kurva standard y = 0.1325x – 0.0455
