HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Tahap Optimasi
4.1.2 Penentuan Waktu Tambat Analit
Hasil penentuan waktu tambat menunjukkan bahwa setiap analit memiliki waktu tambat yang berbeda-beda pada kondisi sistem KCKT yang digunakan. Dari hasil pengujian penentuan waktu tambat analit diperoleh bahwa waktu tambat asesulfam pada 1,387 menit; sakarin pada 2,053 menit; siklamat pada 3,500 menit;
kafein pada 5,633 menit; aspartam pada 9,374 menit; benzoat pada 16,379 menit;
dan sorbat pada kisaran 16,866 menit.
Pada sistem KCKT fase terbalik sebagai fase diam adalah bersifat non polar dan sebagai fase gerak adalah bersifat polar. Sehingga dapat diketahui bahwa asesulfam memiliki kepolaran yang tertinggi diikuti oleh sakarin, siklamat, kafein, aspartam, benzoat, dan sorbat pada sistem KCKT yang digunakan. Data waktu tambat analit akan digunakan sebagai identifikasi setiap analit untuk analisis pengujian selanjutnya. Gambar kromatogram masing-masing analit dapat dilihat pada Lampiran 3 halaman 75 - 78, sedangkan data waktu tambat setiap analit dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 79.
4.1.3 Optimasi pH Fase Gerak
Optimasi pH dapar fosfat dilakukan untuk memperoleh fase gerak yang memberikan pemisahan terbaik. Pengubahan pH dapar berarti mengubah derajat ionisasi molekul dalam larutan. Perubahan tersebut mempengaruhi polaritas senyawa asam dan basa sehingga akan mengubah waktu tambat dan selektivitas senyawa tersebut (Michael, 2006). Larutan dapar yang dipilih harus memberikan pemisahan terbaik berdasarkan nilai resolusi dan faktor kapasitas, selain itu juga memberikan waktu analisis yang lebih singkat. Data parameter hasil optimasi pH dapar fosfat dapat dilihat pada Tabel 4.1. di bawah ini.
Tabel 4.1. Pengaruh pH Dapar Fosfat Terhadap Resolusi
No Analit
pH 3,0 pH 3,5 pH 3,8 pH 4,0
waktu tambat (menit)
Rs k' α waktu
tambat (menit)
Rs k’ α waktu
tambat (menit)
Rs k’ α waktu
tambat (menit)
Rs k’ α
1 Asesulfam 1,623 0,000 0,000 - 1,419 0,000 0,000 - 1,372 0,000 0,000 - 1,370 0,000 0,000 - 2 Sakarin 2,049 3,286 0,449 - 2,018 3,491 0.422 - 1,956 3,563 0.426 - 1,950 3,525 0.423 - 3 Siklamat 3,417 4,528 1,417 3,156 3,415 4,975 1,407 3,334 3,357 5,287 1,447 3,397 3,350 3,128 1,445 3,416 4 Kafein 5,399 5,313 2,819 1,989 5,440 5,528 2,834 2,014 5,405 5,713 2,940 2,032 5,416 5,881 2,953 2,044 5 Aspartam 9,752 8,382 5,898 2,092 9,915 8,664 5,987 2,113 9,949 8,783 6,254 2,127 9,983 8,285 6,285 2,128 6 Benzoat 15,542 Over
lapping - -
13,880 5,232 8,781 1,467 11,543 2,277 7,416 1,186 10,601 0,873 6,736 1,072 7 Sorbat 15,548 15,452 1,774 9,888 1,126 14,298 3,433 9,425 1,271 13,745 4,138 9,031 1,341
Mackenzie dan Erik, (2011), mempergunakan larutan dapar fosfat pH 3 sebagai fase gerak untuk penetapan kadar aspartam, asam benzoat, kafein dan sakarin. Dossi, dkk., (2005), mempergunakan larutan dapar fosfat pH 4 untuk penetapan kadar asesulfam, aspartam, asam benzoat, sakarin, asam sorbat, dan pewarna. Hayun, dkk., (2004), menetapkan kadar sakarin, asam sorbat, kafein, dan aspartam menggunakan dapar asetat pH 5.
Untuk analit yang bersifat asam lemah atau basa lemah maka dapat digunakan fase gerak dapar untuk memperbaiki resolusi dan selektivitasnya. Pada larutan dapar dengan pH lebih rendah maka analit basa akan terionisasi sehingga lebih cepat terelusi, sedangkan analit asam tidak terionisasi sehingga lebih lambat terelusi. Sebaliknya, pada larutan dapar dengan pH lebih tinggi maka analit basa tidak terionisasi sehingga lebih lambat terelusi, sedangkan analit asam akan terionisasi sehingga lebih cepat terelusi. Dapar yang dipilih sebaiknya memiliki kapasitas pH yang baik pada kisaran pH analit yang dianalisis. Dapar yang dipilih juga tidak mengganggu serapan pada panjang gelombang yang dipilih. Pada penelitian ini digunakan larutan dapar fosfat sebagai fase gerak karena memiliki UV cut off < 200 nm (Michael, 2006).
Dari hasil optimasi pH pada tabel di atas terlihat bahwa pada dapar fosfat pH 3,0 terjadi pemisahan yang baik kecuali pada asam benzoat dan asam sorbat yang mengalami overlapping. Pada larutan dapar fosfat pH 3,0 asam benzoat dan asam sorbat relatif tidak terionisasi karena nilai pH yang relatif jauh lebih rendah dari pKa benzoat (pKa 4,2) dan pKa sorbat (pKa 4,8). Hal ini menyebabkan asam benzoat dan asam sorbat berada dalam bentuk tidak terionisasi sehingga waktu tambatnya menjadi lebih lama dan resolusi pemisahannya menjadi buruk. Pada dapar fosfat dengan pH di atas 3,0 menunjukkan pemisahan analit yang lebih baik
dengan nilai resolusi yang memenuhi persyaratan ( > 1,5). Peningkatan pH akan memperbaiki resolusi analit dan mempercepat waktu analisis. Hal ini karena bentuk terionisasi analit menjadi semakin besar sehingga kelarutannya dalam fase gerak polar juga semakin meningkat. Dapar fosfat pH 3,5 dan pH 3,8 memberikan pemisahan yang terbaik dibandingkan dengan dapar fosfat pH 4,0. Pada larutan dapar fosfat pH 4,0 terlihat pemisahan yang kurang baik (Rs = 0,873) antara aspartam dengan benzoat. Larutan dapar fosfat pH 3,8 dipilih karena memberikan pemisahan yang baik serta waktu analisis yang lebih singkat. Dari hasil pengujian juga terlihat bahwa optimasi pH merupakan parameter yang sangat penting untuk menghasilkan pemisahan ketujuh analit yang baik. Gambar kromatogram hasil optimasi pH larutan dapar fosfat dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman 80 – 83.
4.1.4 Optimasi Suhu Oven
Temperatur kolom mempengaruhi kecepatan interaksi antara fase gerak dan fase diam. Bila suhu dinaikkan maka waktu analisis biasanya akan semakin cepat.
Umumnya temperatur analisis yang digunakan adalah 30 oC – 40 oC. Dari hasil optimasi suhu oven diketahui bahwa dengan kenaikan suhu oven berbanding lurus dengan waktu analisis yang semakin cepat. Kenaikan temperatur masih memberikan pemisahan analit yang baik karena proses elusi pemisahan analit pada sistem KCKT yang dipilih berlangsung baik. Kenaikan temperatur oven juga menurunkan tekanan pompa secara signifikan karena viskositas fase gerak umumnya akan menurun dengan naiknya temperatur sehingga tekanan balik yang dialami pompa juga menurun. Dari hasil optimasi suhu oven diperoleh data hasil optimasi berupa waktu analisis, resolusi, faktor kapasitas, dan selektifitas seperti yang terlihat pada Tabel 4.2. Data Hasil Optimasi Suhu Oven di bawah ini.
Tabel 4.2. Pengaruh Suhu Oven Terhadap Resolusi
No. Analit
30 oC 35 oC 40 oC
waktu tambat (menit)
Rs k' α
waktu tambat (menit)
Rs k’ α
waktu tambat (menit)
Rs k’ α
1 Asesulfam 1,372 0 0 - 1,307 0 0 - 1,261 0 0 -
2 Sakarin 1,956 3,563 0,426 - 1,811 3,181 0,386 - 1,7 2,922 0,348 -
3 Siklamat 3,357 5,287 1,447 3,397 3,208 5,536 1,454 3,767 3,07 4,926 1,434 4,121 4 Kafein 5,405 5,713 2,94 2,032 4,75 4,74 2,634 1,812 4,235 3,434 2,358 1,644 5 Aspartam 9,949 8,783 6,254 2,127 8,838 9,034 5,761 2,187 7,89 9,139 5,526 2,344 6 Benzoat 11,543 2,277 7,416 1,186 10,081 2,049 6,712 1,165 8,853 1,823 6,02 1,089 7 Sorbat 14,295 3,442 9,422 1,270 12,758 3,851 8,759 1,305 11,396 4,197 8,035 1,335
Dari data hasil optimasi pada tabel di atas terlihat bahwa seluruh analit yang diuji menunjukkan bentuk puncak yang baik dan tidak pecah, hal ini menunjukkan bahwa analit yang diuji stabil pada kondisi pengujian yang dilakukan. Dari data optimasi suhu oven yang telah dilakukan suhu 40 oC dipilih sebagai hasil optimasi karena memberikan kondisi yang terbaik yaitu pemisahan yang memenuhi persyaratan, waktu analisis yang lebih cepat dan tekanan pompa yang lebih rendah.
Gambar kromatogram hasil optimasi suhu oven dapat dilihat pada Lampiran 6 halaman 84 – 86.
4.1.5 Optimasi Komposisi Fase Gerak
Fase gerak yang dioptimasi adalah dapar fosfat pH 3,8 (pelarut non organik) dan metanol (pelarut organik) dengan perbandingan komposisi 85 : 15, 80 : 20, dan 75 : 25. Larutan dapar fosfat pH 3,8 diperoleh dari hasil optimasi pH dapar fosfat yang telah dilakukan diatas. Pelarut organik yang digunakan adalah metanol. Fase gerak metanol dan dapar fosfat sering digunakan sebagai fase gerak untuk penetapan kadar bahan tambahan pangan. Dari hasil optimasi komposisi fase gerak diperoleh data hasil optimasi berupa waktu analisis, resolusi, faktor kapasitas, dan selektifitas seperti yang terlihat pada Tabel 4.3. Data Hasil Optimasi Komposisi Fase Gerak di bawah ini.
Tabel 4.3. Pengaruh Komposisi Fase Gerak Terhadap Resolusi
No. Analit
75 : 25 (199 kgf/ cm2) 80 : 20 (178 kgf/ cm2) 85 : 15 (168 kgf/ cm2) waktu
tambat (menit)
Rs k' α
waktu tambat (menit)
Rs k' α
waktu tambat (menit)
Rs k' α
1 Asesulfam 1,125 0 0 - 1,235 0 0 - 1,444 0 0 -
2 Sakarin 1,403 1,957 0,247 - 1,676 2,943 0,357 - 2,212 4,771 0,532 -
3 Siklamat 2,534 6,266 1,253 5,073 3,128 6,622 1,533 4,294 4,117 7,838 1,85 3,477 4 Kafein 2,872 1,617 1,552 1,239 4,277 4,022 2,423 1,581 7,438 9,309 4,149 2,243 5 Aspartam 5,269 8,769 3,684 2,374 7,902 9,854 5,399 2,228 12,708 9,774 7,798 1,879 6 Benzoat 6,533 3,548 4,087 1,109 8,86 1,977 6,174 1,144 13,379 0,908 8,262 1,060 7 Sorbat 8,205 3,971 6,293 1,540 11,416 4,653 8,245 1,335 16,89 4,179 10,693 1,294
Dari tabel hasil optimasi komposisi fase gerak diketahui bahwa dengan meningkatnya komposisi metanol akan mempercepat waktu analisis. Waktu analisis yang lebih cepat disebabkan karena kelarutan analit yang lebih besar di dalam metanol dibandingkan kelarutannya dalam dapar fosfat. Namun meningkatnya komposisi metanol juga meningkatkan tekanan pompa secara signifikan yang disertai meningkatnya puncak serapan pengganggu yang terlihat pada kromatogram. Hal ini karena semakin meningkatnya komposisi metanol dalam fase gerak akan meningkatkan tekanan balik (back pressure) pada pompa dan meningkatkan gangguan serapan terutama pada panjang gelombang 200 nm.
Dari data optimasi komposisi fase gerak yang telah dilakukan maka dipilih komposisi dapar fosfat pH 3,8 : metanol (80 : 20) sebagai fase gerak karena memberikan pemisahan yang baik, tekanan yang rendah ( > 200 kgf/cm2), dan gangguan serapan yang lebih sedikit. Gambar kromatogram hasil optimasi komposisi fase gerak dapat dilihat pada Lampiran 7 halaman 87 - 89, sedangkan data hasil optimasinya dapat dilihat pada Tabel 4.3 halaman 53 berikut ini.
4.1.6 Optimasi Laju Alir
Laju alir mempengaruhi waktu analisis dan tekanan pompa pada sistem KCKT yang diuji. Waktu analisis akan semakin cepat dan tekanan pompa akan meningkat karena meningkatnya volume fase gerak yang didorong pompa per satuan waktu. Sedangkan resolusi, faktor kapasitas, dan selektivitas tidak banyak mengalami perubahan dengan perubahan laju alir ini. Dari hasil optimasi laju alir diperoleh data hasil optimasi berupa waktu analisis, resolusi, faktor kapasitas, dan selektifitas seperti yang terlihat pada Tabel 4.4. Data Hasil Optimasi Laju Alir di bawah ini.
Tabel 4.4. Pengaruh Laju Alir Terhadap Resolusi
No. Analit
0,50 ml/mnt (168 kgf/ cm2) 0,55 ml/mnt (192 kgf/ cm2) 0,60 ml/mnt (214 kgf/ cm2) waktu
tambat (menit)
Rs k' α
waktu tambat (menit)
Rs k' α
waktu tambat (menit)
Rs k' α
1 Asesulfam 1,235 0 0 - 1,145 0 0 - 1,059 0 0 -
2 Sakarin 1,676 2,943 0,357 - 1,571 3,021 0,327 - 1,451 2,766 0,369 -
3 Siklamat 3,128 6,622 1,533 4,294 2,94 6,245 1,567 4,792 2,653 5,178 1,504 4,076 4 Kafein 4,227 4,022 2,423 1,581 4,049 4,014 2,535 1,618 3,731 3,651 2,251 1,497 5 Aspartam 7,902 9,854 5,399 2,228 7,528 9,195 5,576 2,200 4,049 9,195 5,576 2,477 6 Benzoat 8,86 1,977 6,174 1,144 8,329 1,619 6,271 1,125 7,773 1,666 6,336 1,136 7 Sorbat 11,42 4,69 8,247 1,336 10,739 4,389 8,375 1,336 9,927 3,508 8,369 1,321
Dari hasil optimasi laju alir di atas diketahui bahwa kenaikan laju alir akan mempercepat waktu analisis namun tetap memberi hasil pemisahan yang baik.
Meningkatnya laju alir juga meningkatkan tekanan pompa. Tekanan yang masih bisa diterima kolom (VP ODS C18) biasanya < 200 kgf/cm2. Tekanan yang dihasilkan dari suatu sistem KCKT sangat bergantung pada berbagai parameter antara lain jenis dan kondisi kolom, kondisi instrumen, laju alir, suhu oven, dan komposisi fase gerak. Laju alir yang dipilih adalah laju alir 0,55 ml/menit karena memberikan waktu analisis yang relatif cepat dengan tekanan yang masih bisa diterima kolom dibandingkan dengan laju alir 0,60 ml/menit dan 0,50 ml/menit.
Kromatogram optimasi laju alir dapat dilihat pada Lampiran 8 halaman 90 – 92.