METODE PENELITIAN
3.5 Penetapan Kadar Nitrit dan Nitrat
3.5.1 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Nitrit Baku
Dipipet 4 ml LIB II nitrit dan dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, ditambahkan 2,5 ml pereaksi asam sulfanilat dan dikocok, setelah 5 menit, ditambahkan 2,5 ml pereaksi N-(1-naftil) etilendiamin dihidroklorida dan dicukupkan dengan air suling sampai garis tanda kemudian dihomogenkan, diukur serapan pada panjang gelombang 400 −800 nm dengan blanko air suling (C = 0,8 μg/ml).
3.5.2 Penentuan Waktu Kerja Nitrit Baku
Dipipet 4 ml LIB II nitrit dan dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, ditambahkan 2,5 ml pereaksi asam sulfanilat dan dikocok, setelah 5 menit, ditambahkan 2,5 ml pereaksi N-(1-naftil) etilendiamin dihidroklorida dan dicukupkan dengan air suling sampai garis tanda kemudian dihomogenkan, diukur serapan pada panjang gelombang 540 nm setiap menit selama 60 menit dengan blanko air suling (C = 0,8 μg/ml).
3.5.3 Penentuan Kurva Kalibrasi Nitrit Baku
Dari LIB II dengan konsentrasi 10 μg/ml, dipipet masing-masing sebanyak 0,7 ml, 2 ml, 2,7 ml, 3,5 ml, 4,2 ml dan 5 ml (0,14 μg/ml; 0,4μg/ml; 0,54μg/ml; 0,7μg/ml; 0,84μg/ml dan 1,0 μg/ml). Masing-masing dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, kemudian ditambahkan 2,5 ml pereaksi asam sulfanilat dan dikocok. Setelah 5 menit, ditambahkan 2,5 ml pereaksi N-(1-naftil) etilendiamin dihidroklorida dan dicukupkan dengan air suling sampai garis tanda kemudian dihomogenkan. Diukur serapan pada menit ke-5 pada panjang gelombang 540 nm. 3.5.4 Penentuan Kadar Nitrit dalam Kornet Daging Sapi, Daging Sapi Burger
dan Daging Sapi Tanpa Pengolahan
Masing-masing sampel sebanyak 10 g yang telah dihaluskan dimasukkan ke dalam beaker glass 250 ml. Kemudian ditambah air suling panas (± 80ºC) sampai volume 150 ml. Diaduk hingga homogen dengan batang pengaduk dan dipanaskan diatas penangas air hingga 2 jam sambil diaduk. Didinginkan pada suhu kamar dan dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu tentukur 250 ml. Ditambahkan air suling sampai garis tanda, dihomogenkan dan disaring, filtrat pertama sekitar 10 ml dibuang. Dipipet 10 ml filtrat dan dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, ditambahkan 2,5 ml pereaksi asam sulfanilat dan dikocok. Setelah 5 menit, ditambahkan 2,5 ml pereaksi N-(1-naftil) etilendiamin dihidroklorida dan dicukupkan dengan air suling sampai garis tanda kemudian dihomogenkan. Diukur serapan pada menit ke-5 dan panjang gelombang 540 nm (Hess, 2000). Kadar nitrit dalam sampel dapat dihitung dengan persamaan regresi Y = aX+b. Rumus perhitungan kadar nitrit:
K =
Keterangan: Y = Absorban
K = Kadar nitrit dalam sampel (μg/g)
X = Kadar nitrit dalam larutan sampel sesudah pengenceran V = volume larutan sampel sebelum pengenceran (ml) Fp = Faktor pengenceran
3.5.5 Penentuan Kadar Nitrat dalam Kornet Daging Sapi, Daging Sapi Burger dan Daging Sapi Tanpa Pengolahan
Masing-masing sampel sebanyak 10 g yang telah dihaluskan dimasukkan ke dalambeaker glass 250 ml. Kemudian ditambah air suling panas (± 80ºC) sampai volume 150 ml. Diaduk hingga homogen dengan batang pengaduk dan dipanaskan diatas penangas air hingga 2 jam sambil diaduk. Didinginkan pada suhu kamar dan dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu tentukur 250 ml. Ditambahkan air suling sampai garis tanda, dihomogenkan dan disaring, filtrat pertama sekitar 10 ml dibuang. Dipipet 10 ml filtrat dan dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, ditambahkan logam Zn (±1 g) didiamkan 10 menit, kemudian ditambahkan 2,5 ml pereaksi asam sulfanilat dan dikocok. Setelah 5 menit, ditambahkan 2,5 ml pereaksi N-(1-naftil) etilendiamin dihidroklorida dan dicukupkan dengan air suling sampai garis tanda kemudian dihomogenkan. Diukur serapan pada menit ke-5 dan panjang gelombang 540 nm. Kadar nitrat dalam sampel dapat dihitung dengan persamaan regresi Y = aX+b.
Rumus perhitungan kadar nitrat (Hess, 2000): K =
( )
Keterangan: Y = Absorban
K = Kadar nitrat dalam sampel (μg/g)
X = Kadar nitrat dalam larutan sampel sesudah pengenceran V = volume larutan sampel sebelum pengenceran (ml) Fp = Faktor pengenceran
Kadar nitrit dari reduksi nitrat = Kadar total nitrit sesudah reduksi – Kadar nitrit sebelum reduksi
Karena hasil pembacaan alat spektrofotometer untuk nitrat adalah sebagai nitrit, oleh sebab itu hasil pembacaan harus dikonfersikan.
Kadar nitrat = kadar nitrit dari reduksi nitrat x 3.6 Uji Validasi Metode Analisis
3.6.1 Uji Perolehan Kembali
Uji perolehan kembali nitrat dan nitrit dapat dilakukan dengan menambahkan larutan baku ke dalam sampel kemudian dianalisis dengan perlakuan yang sama pada sampel. Larutan baku untuk nitrit ditambahkan sebanyak 10 ml dengan konsentrasi 10 μg/ml dan untuk nitrat sebanyak 2 ml dengan konsentrasi 100 μg/ml.
Persen perolehan kembali dapat dihitung dengan rumus (Harmita, 2004): % perolehan kembali = ∗ ×100 %
Keterangan:
CF = Konsentrasi analit dalam sampel setelah penambahan bahan baku CA = Konsentrasi analit dalam sampel sebelum penambahan bahan baku C*A = Konsentrasi bahan baku yang ditambahkan ke dalam sampel 3.6.2 Uji Presisi
Berdasarkan hasil perolehan kembali nitrit dan nitrat ditentukan standar deviasi nitrit dan nitrat. Untuk menghitung standar deviasi (SD) digunakan rumus (Sudjana, 2005):
Keterangan : X = Kadar kandungan zat dalam sampel X = Kadar kandungan zat rata-rata sampel n = Jumlah pengulangan
Berdasarkan nilai standar deviasi yang didapat, dihitung simpangan baku relatif nirit dan nitrat. Simpangan baku relatif dapat dihitung dengan rumus di bawah ini :
RSD = x 100%
Keterangan : = Kadar kandungan rata-rata zat dalam sampel SD = Standar deviasi
RSD =Relative Standard Deviation,Simpangan Baku Relatif 3.6.3 Penentuan Batas Deteksi dan Batas Kuantitas
Batas deteksi atau Limit of Detection (LOD) adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blanko (Harmita, 2004).
Rumus perhitungan batas deteksi: /
Batas kuantitas atau limit of quantitation (LOQ) adalah kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama (Harmita, 2004). Batas kuantitas dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: Batas kuantitasi = /
3.6.4 Analisis Data Secara Statistik
Kadar dapat dihitung dengan persamaan garis regresi dan untuk menentukan data diterima atau ditolak digunakan rumus:
t hitung = /√
µ =X ± (t(α/2, dk)x SD/√n )
Keterangan: µ : kadar sebenarnya
X : kadar analit dalam sampel SD : standar deviasi
dk : derajat kebebasan (dk = n-1)
t : harga t tabel sesuai dengan dk = n-1 α : tingkat kepercayaan
BAB IV