Fraksinasi terhadap konsentrat protein bekatul dilakukan untuk mengetahui pengaruhnya terhadap sifat fungsional protein yang diisolasi dari bekatul yang telah distabilisasi. Fraksinasi protein dilakukan menurut metode Osborne menggunakan lima pelarut, yaitu air, NaCl, etanol 70%, asam asetat, dan NaOH (Hamada et al. 1997). Supernatan dari masing-masing fraksi diukur kadar protein terlarut dengan metode Lowry (Lowry 1951) dan dianalisis berat molekul proteinnya dengan sodium dodecyl sulphat polyacrylamide gel electrophoresis
Gambar 1. Diagram alir pelaksanaan penelitian
Tahap 1 Tahap 2 Tahap 3 Tahap 4
Optimasi Proses Stabilisasi Bekatul dengan Ekstruder Ulir Ganda Tanpa Die menggunakan
RSM
Stabilitas Oksidatif Bekatul
Isolasi dan Karakterisasi Fisikokimia Protein dari Bekatul yang Distabilisasi dengan Ekstruder ulir Ganda
tanpa Die Pengaruh Stabilisasi Bekatul terhadap Fraksi Protein Bekatul Tujuan: menentukan kondisi optimum proses stabilisasi bekatul sebagai bahan baku isolat protein. Bekatul varietas Ciherang Tujuan : mempelajari stabilitas oksidatif bekatul dengan uji Rancimat
Tujuan: mempelajari karakter fisikokimia protein dari bekatul yang distabilisasi dengan ekstruder ulir ganda tanpa die
Tujuan: Mempelajari pengaruh stabilisasi bekatul terhadap fraksi protein bekatul. Bekatul varietas Ciherang
Bekatul varietas Ciherang dan Pandanwangi Bekatul varietas Ciherang dan Pandanwangi Kombinasi proses stabilisasi dengan ekstruder ulir ganda
tanpa die Suhu dan kecepatan ulir optimum Bekatul terstabilisasi Uji rancimat suhu 100,110, 120oC Periode induksi Stabilisasi dengan ekstruder ulir ganda
tanpa die
Kontrol
Isolasi protein bekatul
Karakterisasi fisikokimia protein bekatul Fisikokimia dan sifat fungsional protein bekatul Kontrol Stabilisasi dengan ekstruder
ulir ganda tanpa
die
Konsentrat
protein bekatul Isolasi protein
bekatul Kontrol Stabilisasi dengan ekstruder ulir ganda tanpa die Ekstraksi minyak bekatul Minyak bekatul Kadar air,
protein terlarut, asam lemak bebas, aktivitas lipase dan aktivitas
lipoksigenase Analisis dengan RSM Konsentrat protein bekatul Fraksinasi protein Fraksi protein Kadar protein terlarut dan berat molekul Stabilisasi bekatul
dengan pada kondisi optimum
Metode Analisis
Kadar air (AOAC 2005)
Cawan aluminium dikeringkan dengan oven pada suhu 105oC selama 60 menit, lalu didinginkan dalam desikator selama 30 menit. Cawan kering ditimbang sebelum digunakan. Sekitar 2 gram contoh bekatul ditimbang ke dalam cawan tersebut, kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 105oC selama 6 jam, lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang sampai diperoleh berat tetap. Kadar air dihitung dengan rumus sebagai berikut :
Kadar air (%bb) = a - (b - c) x 100 a
dengan: a = berat contoh awal (g); b = berat contoh dan cawan setelah dikeringkan (g); c = berat cawan kering kosong (g)
Kadar lemak (AOCS 2003)
Labu lemak dikeringkan dalam oven 105oC selama 60 menit, lalu ditimbang sampai diperoleh berat tetap. Sebanyak 10 g contoh bekatul dimasukkan dalam selongsong kertas saring lalu dimasukkan ke dalam alat soxhlet yang telah dihubungkan dengan labu lemak. Lemak dalam contoh diekstrak dengan heksan selama + 6 jam. Heksan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak lemak lalu dikeringkan dalam oven 105oC selama 12 jam. Selanjutnya, didinginkan di dalam desikator dan ditimbang beratnya. Pengeringan diulangi sampai diperoleh berat tetap. Kadar lemak dihitung dalam basis basah (bb) dan basis kering (bk) dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
Kadar lemak (%bb) = a - (b - c) x 100 a
Kadar lemak (%bk) = Kadar lemak (%bb) x 100 (100 - Kadar air)
dengan: a = berat contoh awal (g); b = berat contoh dan cawan setelah dikeringkan (g); c = berat cawan kering kosong (g)
Kadar protein (AOAC 2005)
Sebanyak 100 - 200 mg contoh dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl, lalu ditambahkan 1.9 + 0.1 g K2SO4, 40 + 10 mg HgO, 2.0 + 0,1 mL H2SO4 pekat dan 2-3 butir batu didih. Bahan contoh dipanaskan sampai mendidih selama 1–1.5 jam sampai diperoleh cairan jernih. Setelah didinginkan, isi labu dipindahkan ke dalam labu destilasi dan dibilas menggunakan 1.0 – 2.0 mL air destilata sebanyak 5-6 kali. Air cucian dipindahkan ke labu destilata lalu ditambahkan 8.0-10 mL larutan 60% NaOH-5% Na2S2O3. Sebanyak 5.0 mL larutan H3BO3 dan 2-4 tetes indikator merah metil-biru metil dimasukkan ke dalam erlemeyer dan diletakkan di bawah kondensor dengan ujung kondesor terendam di bawah larutan H3BO3. Proses destilasi dilakukan sampai diperoleh sekitar 15 mL destilat. Destilat diencerkan sampai 50 mL dengan air distilat dan dititrasi dengan HCl 0.02 N yang telah distandarisasi sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu. Volume larutan HCl 0.02 N yang diperlukan dicatat. Hal yang sama dilakukan untuk blanko. Kadar protein diukur berdasarkan kadar nitrogen (%N). Kadar protein
dihitung dalam basis basah (bb) dan basis kering (bk) dengan menggunakan faktor koreksi 5.95 sebagai berikut :
Kadar N (%) = (v1 - v2) x N HCl x 14.007 x 100 w
dengan : v1 = volume larutan HCl untuk contoh (mL); v2 = volume larutan HCl untuk blanko (mL); NHCl = konsentrasi larutan HCL (0.02 N); w = berat contoh (mg)
Kadar protein (%bb) = %N x faktor koreksi (5.95)
Kadar protein (%bk) = Kadar protein (%bb) x 100
(100 - Kadar air)
Kadar asam lemak bebas (AOCS 2003)
Ekstraksi minyak bekatul dilakukan menurut Silpradit et al. (2010) yang dimodifikasi. Bekatul didispersikan dalam heksan (1:5 b/v) lalu diaduk dengan pengaduk magnet selama 60 menit. Selanjutnya dilakukan penyaringan vakum dengan kertas saring. Heksan dihilangkan dari presipitat menggunakan rotary
evaporator suhu 40oC selama 10-15 menit. Sisa heksan dalam minyak dihilangkan dengan dihembus gas N2.
Analisis kadar asam lemak bebas dilakukan menurut metode AOCS (2003). Sebanyak 2.0-2.5 gr minyak dimasukkan ke dalam erlenmeyer, lalu ditambahkan 25 mL alkohol 95% dan 3 tetes indikator fenolftalein, kemudian dititrasi dengan NaOH 0.1 N terstandarisasi hingga diperoleh warna pink tetap selama 10 detik. Volume titran (V) yang digunakan dicatat. Kadar asam lemak bebas dihitung sebagai asam oleat dengan persamaan:
Kadar asam lemak bebas sebagai oleat (%) = mL NaOH x N NAOH x 282
10x berat bahan
Kadar abu (AOAC 2005)
Kadar abu dianalisis menggunakan metode gravimetri. Cawan porselin kosong dan tutupnya dikeringkan dalam oven bersuhu 105oC hingga diperoleh berat tetap. Sebanyak 2 gram bahan ditimbang dalam cawan dan dimasukkan dalam tanur listrik bersuhu 550oC sampai pengabuan sempurna. Setelah pengabuan selesai, cawan didinginkan dalam desikator, lalu ditimbang hingga diperoleh berat tetap. Perhitungan kadar abu dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
Kadar abu (%bb) = Berat bahan akhir x100 Berat bahan awal
Kadar abu (%bk) = Kadar abu (%bb) x 100 (100 - Kadar air)
Kadar Karbohidrat
Kadar karbohidrat dihitung dalam basis basah (bb) dan kering (bk) dengan metode by difference.
Kadar karbohidrat (% bb) = 100 - (%air+%abu+%lemak+%protein) Kadar karbohidrat (% bk) = kadar karbohidrat (%bb) x 100 (100 - kadar air)
Kadar protein terlarut (Lowry 1951)
Kurva standar protein merupakan seri konsentrasi bovine serum albumin
(BSA) 0.12; 0.24; 0.36; 0.48 dan 0.60 mg/mL, masing-masing sebanyak 4 mL ditambahkan 5.5 mL campuran 2% Na2CO3 dalam NaOH 0.1 N dan 1% CuSO4
dalam 2% NaK.Tartrat (1:50 v/v) dibiarkan selama 15 menit pada suhu kamar. Selanjutnya, ditambahkan 0.5 mL pereaksi folin ciocalteu. Campuran dibiarkan selama 30 menit. Absorbansi diukur dengan spektrofotometer pada 600 nm.
Bekatul bebas lemak didispersikan dalam air distilat (1:100 b/v) dan diaduk dengan pengaduk magnetik selama 30 menit lalu disentrifugasi 3000 g (3010 rpm) pada suhu 4oC selama 30 menit. Supernatan direaksikan dengan pereaksi Lowry dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada 600 nm.
Pembuatan bufer fosfat 0.05 M pH 7 (Sudarmadji et al. 1997)
Larutan 0.05 M NaH2PO4.H2O (berat molekul 137.97) (6.9 g dalam 1000 mL) sebanyak 39 mL ditambahkan ke dalam 61 mL larutan 0.05 M Na2HPO4.2H2O (berat molekul 177.97) (8.9 g dalam 1000 mL) lalu diaduk dengan pengaduk magnetik sampai homogen. Larutan ditepatkan sampai 200 mL dengan air deionisasi.
Pembuatan bufer borat 0.01 M pH 8.5 (Sudarmadji et al. 1997)
Larutan 0.01 M asam borat (berat molekul 61.82) (0.62 g dalam 1000 mL) sebanyak 50 mL ditambahkan ke dalam 17.5 mL larutan borax (berat molekul 381) (3.81 g dalam 1000 mL) lalu diaduk dengan dengan pengaduk magnetik sampai homogen. Larutan ditepatkan sampai 200 mL dengan air deionisasi.
Aktivitas lipase (Prabu et al. 1999 yang dimodifikasi)
Bekatul bebas lemak dalam bufer sodium fosfat 0.05 M pH 7 (1:10 b/v) diaduk dengan pengaduk magnetik selama 30 menit pada 10oC. Campuran disentrifugasi 2998 g (3010 rpm) pada suhu 4oC selama 20 menit. Supernatan merupakan ekstrak kasar lipase bekatul (Prabhu et al. 1999). Sebanyak 25 ml 7.5% (b/v) minyak zaitun dalam 7.5% (b/v) gum akasia dalam bufer sodium fosfat 0.05 M pH 7 dihomogenisasi membentuk emulsi. Ditambahkan 2 ml ekstrak kasar lipase ke dalam emulsi (Bhavani et al. 2012). Inkubasi dilakukan dalam penangas goyang 170 rpm selama 30 menit pada 30oC. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 15 ml etanol. Selanjutnya, dititrasi dengan NaOH 0.05 N menggunakan indikator fenolftalein (Prabhu et al. 1999). Satu unit lipase setara dengan jumlah mol asam lemak yang dihasilkan dalam γ0 menit, yang dihitung berdasarkan banyaknya volume NaOH yang dibutuhkan dalam titrasi.
Aktivitas lipase ( mol asam lemak/menit) = (Vsampel - Vblanko) NNaOH x 1000 Vsubstrat
Aktivitas lipoksigenase (Malekian et al. 2000 yang dimodifikasi)
Bekatul bebas lemak (1:10 b/v) dalam bufer sodium fosfat 0.05 M pH 7, diaduk dengan pengaduk magnetik selama 30 menit pada 10oC lalu disentrifugasi 20.021 g (11.000 rpm) selama 10 menit pada suhu 4oC. Ke dalam 4 mL supernatan ditambahkan 0.4 mL TCA 10% lalu disentrifugasi 2998 g (3010 rpm) selama 20 menit. Ke dalam endapan ditambahkan 0.1 mL dietil eter lalu
disentrifugasi pada 20.000 g selama 10 menit pada suhu 4oC. Supernatan dibuang dan endapan dikeringanginkan. Ke dalam endapan ditambahkan buffer fosfat 0.05 M pH 7 hingga 4 mL dan digunakan sebagai sumber enzim (Malekian et al. 2000).
Substrat dibuat dengan melarutkan 25 L asam linoleat dalam15 mL etanol dalam labu 25 mL. Air deionisasi ditambahkan sampai batas tera. Untuk pengujian, sebanyak 1 ml substrat ditambah 6 ml buffer borat pH 8.5 (konsentrasi 0.5 mM). Aktivitas enzim diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada 234 nm, 25oC selama 3 menit. Kuvet contoh mengandung 2.9 mL larutan substrat dan 0.1 mL enzim. Pembentukan hidroperoksida dihitung dengan persamaan (Gardner 2001):
A234(AU/menit) = ɛ (liter/cm/mol) x c (mol/liter) x l (cm) Keterangan:
Aβγ4 = absorbansi pada βγ4
ɛ= koefisien molar 26.800 liter/cm/mL c= konsentrasi hidroperoksida (mol/liter) l = ketebalan cairan dalam kuvet (1 cm)
Uji Rancimat (AOCS 2003)
Stabilitas oksidatif bekatul ditentukan dengan mengukur periode induksi minyak bekatul pada alat Metrohm 743 Rancimat (Metrohm AG, Herisau, Switzerland). Skema alat disajikan pada Gambar 2. Minyak bekatul 5 g ditempatkan dalam tabung, pemanas diatur pada suhu perlakuan (100, 110, dan 120oC), dan kecepatan alir udara 20L/h air flow. Komponen oksidasi yang dihasilkan dialirkan dan ditampung dalam tabung yang berisi air deionisasi untuk diukur konduktivitasnya dengan detektor.
Gambar 2. Skema proses uji Rancimat (Bulletin Food and Beverage Asia 2010)
Analisis asam amino AOAC (2005)
Analisis asam amino menggunakan pereaksi ortoftalaldehid (OPA) yang dapat bereaksi dengan asam amino primer dalam suasana basa yang mengandung merkaptoetanol membentuk senyawa berfluoresensi, sehingga deteksi dapat dilakukan dengan detektor fluoresensi.
a. Persiapan bahan contoh
Preparasi bahan contoh untuk analisis jenis dan kadar asam amino total adalah: (1) pengukuran kadar protein bahan dengan metode Kjeldahl; (2) bahan yang mengandung 3 mg protein dimasukkan ke dalam ampul lalu ditambahkan 1 mL HCl 6 N; (3) bahan dibekukan dalam es kering-aseton lalu dikeringbekukan dengan freeze dryer yang dihubungkan dengan pompa
vakum; (4) udara dalam bahan dikeluarkan dengan mengeluarkan ampul dari dalam es kering-aseton agar mencair dan udara yang terlarut dapat keluar; (5) ampul divakum kembali selama 20 menit dan tutup; (6) ampul dimasukkan dalam oven suhu 110oC selama 24 jam; (7) ampul didinginkan dalam suhu kamar lalu dipindahkan bahan dalam labu evaporator 50 mL dan dibilas dengan 2 mL HCl 0.01 N. Sampel dikeringkan dengan freeze dryer dalam keadaan vakum. Sampel yang telah kering ditambah 5 mL HCl 0.01 N dan siap dianalisis.
b. Persiapan pereaksi
Pereaksi OPA dibuat dengan mencampurkan OPA (50 mg) dalam metanol ( 4 ml) dan merkaptoetanol (0.025 mL) lalu ditambahkan larutan brij-30 brij-30% (0.05 mL) dalam 1M bufer borat pH 10.4. Larutan disimpan dalam botol gelap pada suhu 4oC yang stabil selama 2 minggu. Pereaksi derivatisasi dibuat dengan mencampurkan larutan stok dan bufer kalium borat pH 10.4 (1:1) yang dibuat saat akan digunakan.
Fase mobil bufer A terdiri dari Na-Asetat pH 6.5 (0.025 M). Na-EDTA (0.05%), metanol (9.00%), dan tetrahidrofuran (1.00%) yang dilarutkan dalam 1 liter air kemurnian tinggi (high purity, HP) dan disaring dengan kertas
milipore 0.45 µm. Larutan ini stabil pada suhu kamar selama 5 hari dalam botol gelap yang diisi dengan gas He atau N. Bufer B terdiri atas metanol 95% dan air HP yang disaring dengan kertas milipore 0.45 µm.
Analisis menggunakan HPLC tipe ICI dan kolom ODS dengan kondisi laju aliran fase mobil (1 mL/menit), detektor fluoresensi, dan fase mobil yaitu bufer A dan bufer B dengan gradien disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1. Laju alir fase mobil dan persentase bufer B Waktu (menit) Laju aliran fase mobil
(mL/menit) % Bufer B 0 1 2 5 13 15 20 22 26 28 38 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 15 15 42 42 70 100 100 0 0
c. Analisis bahan contoh
Sampel yang sudah dihidrolisis dilarutkan dalam 5 mL HCl 0.01 N lalu disaring dengan kertas milipore. Bufer kalium borat pH 10.4 ditambahkan dengan perbandingan 1:1. Sampel 10 µL dimasukkan dalam vial lalu ditambahkan 25 µL pereaksi OPA. Sampel dibiarkan 1 menit agar derivatisasi berlangsung sempurna. Sebanyak 5 µL sampel diinjeksikan ke dalam kolom HPLC. Proses pemisahan asam amino berlangsung sekitar 25 menit.
Perhitungan konsentrasi asam amino dalam bahan (dinyatakan dalam µmol AA) adalah:
= Luas puncak bahan x 0.5 µmol/mL x 5 mL Luas puncak standar
Persen asam amino total dalam bahan adalah: = µmol AA x Berat Molekul AA x 100
µg bahan
Tabel 2. Berat molekul asam amino
Analisis spektra FTIR (Adochitei & Drochioiu 2011)
Protein dianalisis menggunakan spektrofotometer IRPrestige-21. Protein (0.1 g) dihomogenisasi dengan KBr anhidrat, lalu diukur pada bilangan gelombang 400 - 4000 cm-1.
Analisis berat molekul konsentrat protein dengan SDS PAGE (Ahmed 2005) Analisis dengan SDS PAGE menggunakan 5% stacking gel dan 12%
separating gel. Sebanyak 100 L larutan protein 0.1% dimasukkan ke dalam ependof, ditambahkan 20 L bufer sampel lalu panaskan selama 2 menit dalam air mendidih 100°C. Sampel (10 L) dan protein ladder dengan berat molekul 10-260 KDa (Fermentas®)) (7 L) dipipetkan ke dalam gel. Running dilakukan pada 70 V selama 180 menit sampai migrasi pewarna tersisa sekitar 0.5 cm dari dasar.
Gel diangkat dan dipindahkan ke dalam wadah untuk pewarnaan (staining) (Gambar 3B). Pewarnaan dilakukan selama 60 menit. Gel diangkat dan dicuci menggunakan air distilat beberapa kali. Penghilangan warna (destaining) dilakukan selama 12 jam hingga latar belakang pita protein menjadi terang. Selanjutnya, larutan penghilang warna dibuang dan gel siap dianalisis.
Secara kualitatif, pita protein dapat dianalisis menggunakan ImageJ software 1.47. Secara kuantitatif, berat molekul protein sampel dapat dihitung dari persamaan regresi yang diperoleh dari kurva hubungan antara mobilitas relatif
Asam Amino Berat Molekul
Aspartat 131.10 Glutamat 147.10 Serin 105.09 Histidin 155.16 Glisin 75.07 Threonin 119.12 Arginin 174.20 Alanin 89.90 Tirosin 181.19 Metionin 149.21 Valin 117.15 Fenilalanin 165.19 Isoleusin 131.17 Leusin 131.17 Lisin 146.19
protein penanda (Rf) dan logaritma berat molekul protein penanda. Mobilitas relatif protein dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein, diukur dari garis awal separating gel sampai ujung pita protein, dan jarak migrasi pewarna.
Mobilitas relatif tersebut dirumuskan sebagai berikut:
(A) (B)
Gambar 3. Proses elektroforesis: (A) running, (B) destaining gel
Larutan kerja yang diperlukan adalah:
a. Larutan A (Akrilamid 30%; 0.8 bisakrilamid) sebanyak 100 mL yang terdiri atas 30 g akrilamid dan 0.8 g N,N-metilen-bisakrilamid dilarutkan dalam 100 mL air distilat. Larutan disaring dengan filter 0.45 m.
b. Larutan B (Tris-HCl/SDS, pH 8.8) sebanyak 100 mL terdiri atas 18.17 g Tris base dan 4 mL SDS 10% dilarutkan dalam 40 mL air distilat. Larutan ditepatkan pada pH 8.8 dengan 1 N HCl, ditambahkan air distilat hingga volume 100 mL. Larutan disaring dengan filter 0.45 m.
c. Larutan C (Tris-HCl/SDS pH 6.8) sebanyak 100 mL terdiri atas 6.05 g Tris base dan 4 mL SDS 10% dilarutkan dalam 40 mL air distilat. Larutan ditepatkan pada pH 6.8 dengan 1 N HCl, ditambahkan air distilat hingga volume total 100 mL. Larutan disaring dengan filter 0.45 m.
d. Larutan 10% APS 0.5 mL dibuat dengan melarutkan 0.025 g amonium persulfat dalam 0.25 mL air distilat.
e. Buffer elektroforesis sebanyak 1 L terdiri atas 3 g Tris base, 14.4 g glisin dan 1 g SDS dilarutkan dalam air distilat dan tepatkan menjadi 1 L.
f. Bufer sampel sebanyak 100 mL terdiri atas 30 mL 10% SDS, 10 mL gliserol, 5 mL 2-merkaptoetanol, 12.5 mL Tris-HCl/SDS pH 6.8 dan 5-10 mg
bromphenol blue diaduk dengan pengaduk magnetik, lalu ditepatkan 100 mL dengan air distilat, dan disimpan pada suhu rendah.
g. Larutan pewarna (staining solution) yaitu 1 g coomasie brilliant blue R-250, dalam 450 mL methanol, 100 mL asam asetat glasial, dan 450 mL air distilat. h. Larutan penghilang warna (destaining solution), yaitu 100 mL metanol dan 100
mL asam asetat glasial dalam 800 mL air distilat.
Bufer KCl-HCl pH 2 (Sudarmadji et al. 1997)
Pembuatan larutan bufer pH 2 dilakukan dengan mencampurkan 50 mL larutan 0.2 M KCl (14.9 g dalam 1000 mL) ke dalam 10.6 mL larutan 0.2 M HCl. Selanjutnya, ditepatkan sampai 200 mL dengan air deionisasi.
Rf = Jarak migrasi protein Jarak migrasi pewarna
Bufer universal pH 3-9 (Sudarmadji et al. 1997)
Sebanyak 100 mL larutan A yang mengandung asam sitrat (6.008 g), KH2PO4 (3.893 g), H3BO3 (1.769 g), dan dietilbarbiturat (5.266 g) diencerkan sampai 1000 mL dengan air deionisasi. Untuk memperoleh pH 3-9, 100 ml larutan A ditambah dengan 0.2 N NaOH sebagaimana disajikan pada Tabel 3 di bawah ini.
Tabel 3. Formulasi bufer universal Larutan A (mL) NaOH 0.2 N (mL) pH 100 6.4 3 100 15.5 4 100 27.1 5 100 38.9 6 100 50.6 7 100 63.7 8 100 72.7 9
Indeks kelarutan nitrogen (Zhang et al. 2012 yang dimodifikasi)
Larutan protein (1% b/v) dalam bufer universal pH 2-9 diaduk dengan pengaduk magnetik pada suhu kamar selama 30 menit, lalu disentrifugasi pada 9096 g selama 20 menit (Zhang et al. 2012 yang dimodifikasi). Protein terlarut dalam supernatan ditentukan dengan menggunakan Metode Lowry (Lowry et al. 1951), dan persen kelarutan nitrogen dihitung sebagai berikut:
NSI (%) = Total kandungan protein dalam supernatan × 100% Total kandungan protein dalam sampel
Kapasitas dan stabilitas buih (Yeom et al. 2010yang dimodifikasi)
Kapasitas buih (foaming capacity, FC) dan stabilitas buih (foaming stability,
FS) ditentukan menurut Yeom et al. (2010) yang dimodifikasi. Sebanyak 25 mL larutan protein dengan konsentrasi 1% (b/v) dalam bufer universal pH 2, 4, 6, dan 8, diaduk dengan pengaduk magnetik skala maksimum selama 5 menit. Larutan contoh segera dituang ke dalam gelas ukur lalu volume buih yang terbentuk dicatat. Persentase FC dihitung dari persamaan berikut:
FC (%) = Volume setelah berbuih - Volume sebelum berbuih x 100 Volume sebelum berbuih
FS ditentukan oleh rasio volume buih pada menit ke-30 dan volume buih setelah berbuih pada suhu kamar (menit ke-0).
(A) (B)
Aktivitas dan stabilitas emulsi (Yeom et al. 2010 yang dimodifikasi)
Aktivitas pengemulsi (emulsifying activity, EA) dan stabilitas emulsi (emulsion stability, ES) ditentukan dengan metode turbidimetri. Minyak kedelai sebanyak 16 ml dan 48 ml larutan protein 1% (b/v) dalam bufer universal (pH 2, 4, 6, 8) dihomogenisasi dengan homogenizer skala maksimum selama 1 menit untuk menghasilkan emulsi. Sebanyak 50 µL bagian emulsi dipipet dari bawah wadah pada menit ke-0 dan 20 setelah dihomogenisasi dan dicampur dengan 5 mL 0.1% SDS. Absorbansi emulsi diukur pada 500 nm dengan UV-VIS Spektrofotometer.
Gambar 5. Suspensi emulsi minyak kedelai dalam larutan protein bekatul pH 2, 4, 6, dan 8
Teori hamburan cahaya oleh dispersi partikel menunjukkan kekeruhan yang memiliki hubungan dengan luas antar permukaan emulsi. Absorbansi yang diukur segera setelah pembentukan emulsi dinyatakan sebagai aktivitas pengemulsi dari protein, sedangkan stabilitas emulsi ditentukan sebagai berikut:
ES = T0× Δt
ΔT
dimana △T adalah perubahan kekeruhan (absorbansi) dari T0 dalam interval waktu △ t, dan T0 adalah absorbansi emulsi setelah homogenisasi.
Kapasitas penyerapan air dan minyak (Marriod et al. 2010)
Konsentrat protein contoh (0.1 g) dicampur dengan 1 g air distilat atau minyak kedelai dalam ependof lalu digojog dengan alat vortex selama 5 menit. Selanjutnya, didiamkan selama 30 menit lalu disentrifugasi pada 5956 g (6000 rpm) selama 30 menit. Supernatan dibuang dan tabung dimiringkan 45o selama 30 menit. Gram air atau minyak yang tertahan dalam bahan contoh dihitung dalam per gram bahan contoh.
Stabilitas terhadap panas (Mariod et al. 2010)
Konsentrat protein conroh (0.065 g) disegel kedap udara dalam wadah aluminium, dipanaskan dari suhu 40°C sampai 150°C pada kecepatan 10°C/menit. Sifat termal direferensikan terhadap wadah tanpa contoh. Suhu puncak denaturasi (Tp) dan entalpi (ΔH) dihitung dengan perangkat lunak program analisis termal (Pyris-I-DSC, Perkin-Elmer DSC 7 Ver.9.01 2007).
Analisis kadar fitat (Bhandari & Kawabata 2006)
Bekatul dan konsentrat protein, masing-masing diekstrak dengan 2.4% HCl (1:20 b/v) selama 60 menit pada suhu kamar, lalu disentrifugasi pada 6317 g (5000 rpm) selama 30 min. Supernatan yang diperoleh dianalisis kadar asam
fitatnya. Sebanyak 1 mL pereaksi Wade (0.03% FeCl3·6H2O mengandung 0.3% asam sulfosalisilat dalam air distilat) ditambahkan dalam 3 mL larutan contoh diamkan selama 5 menit dan diukur absorbansi pada 500 nm. Kurva standar asam fitat dibuat seri konsentrasi yang mengandung 5–40 g/mL asam fitat dalam pelarut air distilat.
Analisis berat molekul fraksi protein dengan SDS PAGE (Ahmed 2005) Analisis dengan SDS PAGE menggunakan 7.5-17.5% stacking gel dan
gradient separating gel. Sebanyak 10-20 L supernatan dari masing-masing fraksi dimasukkan ke dalam ependof, ditambahkan bufer Laemmli (Sigma) (1:1 v/v), lalu dipanaskan 2 menit dalam air mendidih 100°C. Sebanyak 20 L contoh fraksi albumin dan globulin, 10 L contoh fraksi glutelin, dan 10 L protein penanda dipipetkan ke dalam kolom-kolom gel. Protein penanda yang digunakan merupakan Board Range Catalog 161-0318 Biorad Prestained Molecular Standar
yang mengandung 8 jenis protein standar yaitu myosin (230 kDa), -galaktosidase (118 kDa), bovine serum albumin (86 kDa), ovalbumin (51.6 kDa), karbonik anhidrase (34.1 kDa), soybean trypsin inhibitor (29 kDa), lisozim (19.2 kDa), dan aproitin (7.5 kDa). Running dilakukan pada 100 V selama 180 menit sampai migrasi pewarna tersisa sekitar 0.5 cm dari dasar.
Setelah migrasi pewarna tersisa sekitar 0.5 cm dari dasar, alat dimatikan lalu gel diangkat dan dipindahkan ke dalam wadah untuk pewarnaan (staining). Pewarnaan dilakukan selama 60 menit. Gel diangkat dan dicuci menggunakan air distilat beberapa kali. Penghilangan warna (destaining) dilakukan selama 12 jam hingga latar belakang pita protein menjadi terang. Selanjutnya, larutan penghilang warna dibuang dan gel siap dianalisis.
Secara kualitatif, pita protein dapat dianalisis menggunakan ImageJ software 1.47. Secara kuantitatif, berat molekul protein sampel dapat dihitung dari persamaan regresi yang diperoleh dari kurva hubungan antara mobilitas relatif protein penanda (Rf) dan logaritma berat molekul protein penanda. Mobilitas relatif protein dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein, diukur dari garis awal separating gel sampai ujung pita protein, dan jarak migrasi pewarna.
Mobilitas relatif tersebut dirumuskan sebagai berikut:
Pembuatan gradient gel menggunakan alat Biorad Model 385 Gradient Former (Gambar 6B) dengan formulasi bahan disajikan pada Tabel 4.
(A) (B)
Gambar 6. Gel elektroforesis: (A) stacking gel dan separating gel (Ahmed 2005) dan (B) gradient former Biorad
Rf = Jarak migrasi protein Jarak migrasi pewarna
Tabel 4. Formulasi bahan separating dan stacking gel elektroforesis
Diameter partikel (Xia et al. 2012)
Pengukuran diameter partikel konsentrat protein menggunakan particle size
analyzer (Malvern Mastersizer MS2000) pada suhu 25oC menggunakan
pendispersi air.
Analisa Statistik
Pengujian dilakukan 2 kali ulangan dan nilainya di rata-rata. Perbedaan antar perlakuan dianalisis dengan uji t-test pada perangkat SPSS 16.0 dengan signifikasi p<0.05 antar nilai rata-rata.
Daftar Pustaka
Adochitei A, Drochioiu G. 2011. Rapid characterization of peptide secondary structure by FT-IR spectroscopy. Revue Roumaine de Chimie 56 (8): 783-791
Ahmed H. 2005. Principles and Reaction of Protein Extraction, Purification and Characterization. CRC Press LLC.
[AOCS] American Oil Chemists Society. 2003. Official Methods and Recommended Practices of the AOCS. 5th ed. Champaign, Illinois: AOCS [AOAC] Association of Official Analytical Chemists. 2005. Official Methods of
Analysis of the AOAC. Washington DC: AOAC
Bhandari MR, Kawabata J. 2006. Cooking effect on oxalate, phytate, trypsin and amylase inhibitors of wild yam tubers of Nepal. J. Food Composition Anal.
19 (6-7):524-530.
Bhavani M, Chowdary GV, David M, Archana G. 2012. Screening, isolation and biochemical characterization of novel lipase producing bacteria from soil samples. Int. J. Biol. Eng. 2(2): 18-22
Bahan Konsentrasi gel
7.5% 17.5% Stacking gel Akrilamid 40% 970 µl 485 µl Bis akrilamid 2% 520 µl 260 µl dd H2O 5.9 ml 2.95 µl Tris HCl pH 8.8 2.5 ml 1.25 ml 10% SDS 100 µl 50 µl TEMED 10 µl 5 µl 10% APS 50 µl 25 µl Separating gel Akrilamid 40% 4.55 ml 10.63 ml Bis akrilamid 2% 2.5 ml 5.86 ml dd H2O 1.33 ml 1.88 ml Tris HCl pH 8.8 6.25 ml 6.25 ml 10% SDS 250 µl 250 µl TEMED 12.5µl 12.5 µl 10% APS 125 µl 125 µl
Gardner HW. 2001. Current protocols in food analytical chemistry: Analysis of lipoxygenase activity and products. Chapter 4.2.1-Chapter 4.2.16, John Wiley & Sons, Inc.
Hamada JS. 1997. Characterization of protein fractions of rice bran to devise effective methods of protein solubilization. Cereal Chem. 74 (5):662–668 Internet: Bulletin Food and Beverages Asia. 2010. Ingredient. January/February,