A. WAKTU DAN TEMPAT
1. Pengembangan Metode Penetapan Kadar Siklamat
Percobaan pengembangan metode penetapan kadar siklamat dilakukan berbasis instrumen KCKT dan dilaksanakan dalam dua tahap yaitu pengembangan fase gerak KCKT dan pengembangan metode ekstraksi siklamat dari matriks pangan. Pada pengembangan fase gerak KCKT, yang menggunakan bufer fosfat dan metanol, diterapkan perlakuan pengubahan rasio fase gerak untuk memperoleh pemisahan siklamat yang optimal. Sebagai indikator adalah waktu retensi (tR), faktor kapasitas (k’), dan resolusi (R). Untuk pengembangan metode ekstraksi digunakan prosedur ekstraksi cair-cair dengan suatu modifikasi yaitu mengubah kondisi pH larutan sampel hingga pH 1 untuk menghasilkan tingkat ekstraksi siklamat yang optimal. Parameter keberhasilan ekstraksi adalah koefisien distribusi (KD), rasio distribusi (nilai D) dan persen terekstrak (%E). Bagan alir bagian ini dapat dilihat pada Gambar 2.
Model pangan (Na-siklamat) Standar siklamat
Dilarutkan dalam air (Na+ + [siklamat]- )
sistem KCKT
+ H2SO4 hingga pH 1 (komposisi fase gerak bufer fosfat – [H-siklamat]aq metanol 75:25, 80:20, 85:15)
ekstraksi dengan pelarut organik optimasi puncak dan luas area [H-siklamat]org
Metode terpilih
a) Penentuan Fase Gerak KCKT 1) Spesifikasi KCKT
Prosedur Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dengan mode fase terbalik ini mempunyai spesifikasi sebagai berikut:
Kolom : Oktadesilsilane RP-18, ukuran partikel 5 μm, dimensi 250 mm x 4.6 mm ID Spesifikasi : HPLC Shimadzu Prominence LC-20AD Fase gerak : Bufer fosfat (KH2PO4) pH 4.6 : Metanol Laju aliran : 1 ml/menit
Tekanan : 75–78 kgf/cm3
Detektor : UV-Vis 200 nm; suhu oven 400C LC mode : low pressure; tipe isokratik Volume penyuntikan : 20 μl
2) Rasio Fase Gerak
Pada kromatografi fasa terbalik yang menggunakan fase gerak polar, untuk menghasilkan pemisahan siklamat (polar), kepolaran sistem fase gerak diatur sedemikian rupa sehingga siklamat dapat terelusi. Dalam komposisi fase gerak bufer fosfat dan metanol, hal ini dilakukan dengan mengubah-ubah rasio metanol. Perlakuan rasio fase gerak yang dilakukan adalah bufer fosfat (KH2PO4):Metanol = 75:25, 80:20, 85:15. Kondisi optimal yang diinginkan mengacu pada prinsip pemisahan sebaik mungkin dengan waktu analisis seminimal mungkin (Zhu et al. 2005). Percobaan optimasi fase gerak dilakukan dengan larutan standar siklamat.
3) Pengamatan
- Waktu retensi komponen yang diamati (tR) - Waktu retensi komponen tidak ditahan (tm) - Faktor kapasitas (k’) : (tR - tm) / tm
- Resolusi (R)
b) Pengembangan Metode Ekstraksi
Proses ekstraksi dalam analisis siklamat ini terutama ditujukan untuk menghilangkan berbagai komponen pangan seperti pati, protein,
lipida, pewarna dan sebagainya, sehingga memudahkan analisis selanjutnya dengan KCKT. Dalam sistem ekstraksi cair-cair, siklamat terdapat sebagai fase cairan dan sebagai fase organik adalah eter. Selama ekstraksi, terjadi perpindahan/distribusi siklamat dari fase cairan ke fase organik.
1) Pembuatan Model Pangan
Untuk keperluan percobaan pengembangan metode ekstraksi dibuat tiga macam model pangan yang mewakili bentuk pangan yaitu pangan cair (minuman ringan), semi padat (puding/agar), dan pangan padat (roti). Proses pembuatan model pangan sebagai berikut:
(i) Minuman Ringan (Ningrum, 2005)
Dimasukkan 25 g sukrosa (10%), 250 mg benzoat (0.1%), dan 250 mg asam askorbat (0.1%) dalam 250 ml air kemudian diaduk merata. Dipanaskan hingga 80 0C selama 10 menit, sambil ditambahkan 250 mg Na-siklamat sehingga diperoleh konsentrasi 1,000 mg/l (250 miligram siklamat dalam 250 mililiter larutan). Selanjutnya larutan disaring kemudian dimasukkan botol gelap dan kedap udara.
(ii)Puding/agar (Ningrum, 2005)
Duapuluh empat gram (12%) gula dilarutkan dalam 200 ml air. Kemudian dimasukkan 1.4 g bubuk agar (0.7%) dan 320 mg Na-siklamat (konsentrasi 1,600 mg/l), lalu dipanaskan hingga mendidih. Setelah didinginkan hingga suhu sekitar 60 0C dan penambahan sedikit flavor serta pewarna, lalu dimasukkan cetakan dan disimpan di wadah gelap serta kedap cahaya.
(iii)Roti
Limapuluh gram telur (20%) bersama 75 g gula pasir (30%) dikocok merata, lalu dimasukkan 75 g tepung terigu (30%) sedikit demi sedikit sambil ditambahkan 50 g air (20%). Adonan diaduk hingga kalis/homogen, lalu dimasukkan 500 mg Na-siklamat sehingga konsentrasi 2,000 mg/kg (500 miligram dalam 250 gram
adonan). Selanjutnya adonan dituang ke cetakan lalu dikukus hingga matang.
2) Ekstraksi Cair-Cair
Sejumlah 20–25 gram atau mililiter sampel model pangan ditimbang, dimasukkan gelas piala 100 ml dan ditambah ± 50 ml air kemudian diaduk hingga homogen [Vo]. Kemudian ditambah larutan H2SO4 10% hingga pH 1.
Selanjutnya dimasukkan corong pemisah, ditambah 20–25 ml eter, kemudian dikocok/digoyang kira-kira 20 kali hingga terbentuk 2 lapisan yaitu lapisan eter diatas, sampel dibawah. Pengocokan dapat dibantu dengan shaker selama 15 menit. Cairan eter sangat volatil/ mudah menguap sehingga tiap kali habis mengocok hendaknya tutup/kran corong pemisah dibuka hati-hati untuk mengeluarkan uap.
Lapisan eter dipisahkan dari fraksi cairan sampel dan dicuci 2 kali setiap kali dengan 10 ml air. Untuk membantu pembentukan lapisan, ditambahkan 20 ml NaCl jenuh untuk menghindari emulsifikasi. Air cucian dikumpulkan bersama fraksi cairan sampel kemudian ekstraksi diulangi kembali 2 kali, setiap kali dengan 20–25 ml eter dan dishaker 15 menit.
Ekstrak eter hasil tiap kali ekstraksi dikumpulkan pada gelas piala 100 ml, lalu diuapkan fraksi eternya sampai hampir kering. Selanjutnya sisa penguapan dilarutkan dalam pelarut (metanol) dan ditetapkan hingga tanda tera pada labu takar 50 ml [VE]. Larutan ini sudah berfungsi sebagai larutan uji dan siap diinjeksikan ke instrumen KCKT.
3) Uji Kualitatif (Identifikasi)
Uji kualitatif siklamat umumnya dilakukan dengan metode sodium nitrite test (AOAC, 1999), tetapi dalam penelitian ini identifikasi dilakukan sekaligus dengan instrumen KCKT. Sebelumnya ditentukan terlebih dahulu nilai LOD (Limit of Detection). LOD adalah konsentrasi terkecil suatu senyawa yang dapat terdeteksi secara
kualitatif (WHO, 1985; Snyder, 1997). Penentuan nilai LOD berdasarkan prosedur kalibrasi.
Prosedur uji kualitatif dengan KCKT dilakukan berdasarkan hasil pengembangan komposisi fase gerak KCKT, yang diperoleh sebagai berikut:
Kolom : Oktadesilsilane RP-18, ukuran partikel 5 μm, dimensi 250 mm x 4.6 mm ID
Fase gerak : Larutan KH2PO4 pH 4.6 : Metanol
85 : 15
Laju aliran : 1 ml/menit Volume penyuntikan : 20 μl
Detektor : UV-Vis, 200 nm
Keberadaan siklamat ditentukan dengan membandingkan waktu retensi sampel yang diduga mengandung siklamat dengan waktu retensi standar siklamat (Wasik & Buchgraber, 2007). Jika sampel menghasilkan puncak dengan waktu retensi disekitar waktu retensi standar siklamat maka dapat diduga sampel pangan tersebut positif mengandung siklamat.
4) Uji Kuantitatif/Pengukuran Konsentrasi Siklamat
Sebelum dilakukan pengukuran konsentrasi siklamat, perlu ditetapkan terlebih dahulu nilai LOQ (Limit of Quantification), yaitu konsentrasi terkecil suatu senyawa yang dapat ditentukan secara kuantitatif (WHO, 1985; Snyder, 1997). Nilai LOQ suatu instrumen perlu diketahui untuk menentukan konsentrasi terendah senyawa yang terdapat dalam sampel yang bisa diukur oleh instrumen tersebut. Penentuan nilai LOQ didasarkan seperti prosedur kalibrasi.
Untuk persiapan kalibrasi dibuat larutan baku induk dengan cara melarutkan 1.0423 g standar siklamat pada pelarut metanol hingga volume 100 ml, sehingga diperoleh konsentrasi 10,423 mg/l (ppm). Adapun sebagai larutan uji digunakan cairan hasil ekstraksi.
Sebanyak 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, dan 8 ml larutan baku induk dipipet dan dimasukkan dalam labu takar 50 ml, kemudian diencerkan
dengan metanol sampai tanda tera sehingga diperoleh serangkaian larutan baku kerja seperti tertera di Tabel 5. Selanjutnya larutan baku kerja disaring dengan membran filter 0.45 um dan dihampaudarakan dengan ultrasonic bath, sebelum siap diinjeksikan.
Tabel 5 Penyiapan larutan baku kerja untuk pengukuran siklamat pada sampel model pangan
No. Volume labu takar, V1 (ml) Volume pengambilan baku induk, V2 (ml) a Konsentrasi baku kerja, M1 (mg/l) b 1 50 1 208.46 2 50 2 416.92 3 50 3 625.38 4 50 4 833.84 5 50 5 1,042.30 6 50 6 1,250.76 7 50 7 1,459.23 8 50 8 1,667.68
a) Konsentrasi baku induk (M2) = 10,423 mg/l
b) M1 = (V2 x M2) / V1
Larutan baku kerja dan larutan uji masing-masing disuntikkan secara terpisah kedalam instrumen KCKT yang telah dicapai kondisi optimalnya. Urutan injeksi dimulai dari larutan baku kerja konsentrasi terendah ke konsentrasi tinggi, kemudian dilanjutkan dengan larutan uji.
Dari serangkaian larutan baku kerja dibuat kurva kalibrasi dengan memplot peak area pada sumbu y dengan konsentrasi pada sumbu x. Kemudian dibuat garis lurus berdasar persamaan y = ax + b, dimana a adalah slope dan b nilai intersep yang memotong sumbu y (Wasik & Buchgraber, 2007). Jika kurva menunjukkan garis lurus, maka persamaan garis kurva kalibrasi dapat digunakan untuk perhitungan konsentrasi siklamat pada cairan ekstrak.
Respon kromatogram yang diukur adalah peak area siklamat dalam cairan ekstrak (Wasik & Buchgraber, 2007). Apabila peak area pada ekstrak melebihi peak area tertinggi larutan baku kerja maka dilakukan pengenceran terhadap cairan ekstrak kemudian hasil pengenceran dianalisis kembali.
Kadar siklamat ditentukan dengan mengintegrasi peak area larutan uji pada persamaan kurva kalibrasi. Konsentrasi siklamat cairan ekstrak dihitung dengan persamaan: (Wasik & Buchgraber, 2007)
R – b
Ce = ... (5)
a dimana : R = peak area respon siklamat
a = slope b = intersep
Ce = konsentrasi siklamat pada cairan ekstrak (mg/l) Adapun perhitungan kadar siklamat pada sampel menggunakan rumus :
mg Ce x V1 x V3 mg x l x ml
[S] = ...(6)
kg M x V2 l x kg x ml
Ce = konsentrasi siklamat pada ekstrak, hasil persamaan (5) M = berat sampel yang diambil untuk ekstraksi (kg)
V1 = volume larutan hasil ekstraksi, misal 0.05 l
V2 = volume larutan ekstrak untuk pengenceran, misal 10 ml V3 = volume akhir hasil pengenceran, misal 50 ml
5) Pengamatan Parameter Ekstraksi
- [S]E : konsentrasi siklamat dalam fase organik - [S]O : konsentrasi siklamat dalam fase cair
- pH : indikator kertas pH
- [V]E : volume akhir fase pengekstrak - [V]O : volume awal sampel
- Koefisien Distribusi (KD) : [S]E / [S]O
- Rasio Distribusi (D) : KD / {1+(Ka/[H+])}
Siklamat terekstrak/terdistribusi ke dalam fase organik jika nilai D mendekati nilai KD.
- Persen terekstrak (%E): {[S]E VE / ([S]E VE + [S]O VO)} x 100 Kriteria (%E) adalah 95–105% untuk analit sejumlah 1,000 mg/kg (Swartz & Krull, 1997).