Percobaan I. Isolasi dan Identifikasi Kapang Entomopatogen Lagenidium
4. Penghitungan dan Pengamatan Zoospora dan Oospora
Penghitungan zoospora dan oospora yang dihasilkan dengan menggunakan malazzes hemocytometer dan pengamatan dilakukan dengan menggunakan bantuan mikroskop dengan perbesaran 10x dan 40x. Zat warna yang digunakan Lacto phenol cotton blue (LPCB).
HASIL dan PEMBAHASAN
Pemeliharaan isolat Lagenidum giganteum, salah satu tujuannya supaya isolat tersebut tidak mati dan dalam pemeliharaan ini membutuhkan waktu yang lama karena selama pemeliharaan seringkali ditemukan banyak terjadi kendala. Dalam pemeliharaan ini dari isolat murni dibiakkan ke dalam media biakan agar seperti yang dilakukan oleh Kerwin dan Wasino (1986). Kuning te lur yang ada dalam media biakan ini digunakan sebagai sumber utama untuk pertumbuhan kapang L. giganteum yang meliputi lemak, karbohidrat, protein dan elemen organik yang meliputi sulfur, potassium, sodium, fosfor, kalsium, magnesium dan besi (Stadelman dan Cotterill(1977) dalam Misman, 1990). Sedangkan sumber karbon untuk pertumbuhan kapang ini selain berasal dari glukosa yang ada pada kuning telur juga berasal dari glukosa yang ditambahkan pada media diatas. Menurut Bilgrami dan Verma (1981) dalam Misman (1990) bahwa unsur karbon diperlukan oleh kapang tersebut untuk menyusun komponen miselium kapang.
Dari penelitian ini setelah kapang L. giganteum ditumbuhkan pada media khusus (Domnas et al. 1983) yaitu kombinasi antara media PYG (pepton, yeast ekstrak dan glukosa) dengan pH 6,5 dan Medium Z pH 6,0 dan didiamkan pada air bebas ion selama 2 hari maka dihasilkan zoospora yang merupakan stadium infektif , bersifat motil dan merupakan alat reproduksi aseksualnya (Gambar 4). Jumlah zoospora yang dihasilkan sete lah dihitung dengan Malassez hemocytometer sebesar 15 x 107 zoospora/ml.
Dalam siklus hidupnya Lagenidium mempunyai siklus hidup yang relatif sederhana, terdiri dua siklus yang terpisah yaitu aseksual sebagai zoospora dan siklus seksual dengan oospora (Dwidjoseputro 1978). Dalam lingkungan perairan kapang L. giganteum mempunyai dua fase yaitu bersifat saprofit ik dan parasitik. Fase parasitik bersifat motil, berbentuk bulat dan mempunyai 2 flagella pada bagian lateralnya.
Gambar 4. Zoospora 40x
Tahap infektif dari kapang ini adalah tahap spora (zoospora). bersifat motil dan memiliki kemampuan untuk mencari sekaligus merusak inangnya dengan cara menangkap sinyal yang dihasilkan pada bagian epikutikula (eksoskeleton bagian
luar) nyamuk. Zoospora dapat ditemukan menempel pada batang padi, kumbang air ataupun larva capung. Apabila zoospora belum menemukan inang yang cocok, zoospora akan berenang kembali dan mencari inang yang sesuai (Melvin et al. 1987; Kerwin 1990 ; Kerwin 2000). Secara in vitro produksi zoospora akan dapat tercapai apabila ditumbuhkan pada media biakan yang mengandung cukup nutrisi dan pH yang sesuai.
Gugus trehalosa merupakan sumber karbon terbaik selain glukosa, mannosa, fruktosa, maltosa dan gliserol selain itu kapang ini juga membutuhkan aspartat, glutamat dan glutamin sebagai sumber nitrogen (McInnis (1971) dalam Misman (1990). Kapang akan mempunyai enzim ekstrasel protease apabila ditumbuhkan pada media PYG dan dalam memproduksi enzim ini juga dibutuhkan suatu perangsang protein. Pada penelitian ini miselium kapang ditumbuhkan dalam media biakan cair yang mengandung PYG dan ditambah suplemen minyak jagung. Minyak jagung digunakan sebagai sumber sterol yang digunakan sebagai bahan tambahan yang akan digunakan untuk menginduksi terjadinya proses zoosporogenesis. Menurut Domnas et al. (1977) media biakan yang mengandung PYG perlu ditambahkan unsur protein baik berupa kolesterol ataupun protein nabati untuk memicu terjadinya zoosporogenesis. Selain itu dengan penambahan protein tersebut akan memicu juga produksi enzim protease menjadi dua sampai tiga kali lipat dan waktu pertumbuhan akan menjadi dua kali lebih cepat apabila dibandingkan dengan tanpa penambahan suplemen. Enzim protease membantu proses zoospora dalam melakukan penetrasi ke dalam lapisan kutikula dari nyamuk disamping enzim lipase (Domnas et al. 1974). Menurut Jaronski et al. (1983) bahwa apabila kapang L. giganteum ditumbuhkan pada
media yang bebas sterol proses zoosporogenesis akan terhambat dan kemampuan pembentukkan zoospora akan tertahan apabila kapang ditumbuhkan pada media PYG setelah beberapa bulan (Lord dan Robert 1986).
Kisaran pH yang dibutuhkan dalam produksi zoospora secara in vitro adalah 4,5-8,4 (Lord dan Robert 1985) sedang menurut Domnas et al. (1982) bahwa produksi zoospora kisaran pH yang digunakan adalah 5,4-7,5 dan pH optimal apabila menggunakan media PYG adalah 6,5-7,5). L. giganteum akan mampu memproduksi zoospora secara optimal apabila setelah ditumbuhkan ke media PYG, harus ditumbuhkan pada media Z dengan pH 5,5-6,0 (Balaraman dan Hoti (1986) dalam Misman, 1990) .
Dalam penelitian ini untuk memperoleh proses zoosporogenesis secara sempurna, suspensi zoospora dimasukkan kedalam cawan-cawan petri yang berisi air bebas ion steril yang diinkubasikan pada suhu 250C selama 3 hari dan diperoleh hasil adanya germline pada dasar petri. Menurut Kerwin et al. (1986) bahwa untuk memacu terjadinya zoosporogenesis nutrisi yang terkandung di media biakan, digunakan juga aquades steril, sedangkan Domnas et al. (1977) menggunakan air bebas ion sebagai pemacu zoosporogenesis.
Dalam penelitian ini untuk menghasilkan oospora, zoospora yang telah dihasilkan kemudian dibiakkan kembali kemedia yang mengandung yeast ekstrak 2,8g/lt, glukosa 2,4 g/lt, wheat germ 3,2g/lt, cotton seed oil dan cotton seed flour serta ditambah beberapa milimolar unsur kalsium dan magnesium. Inkubasi dilakukan selama 7-10 hari. Setelah 7 hari miselium dipanen dan dilarutkan dalam aquades steril dan diinkubasi kembali selama 7 hari. Pada hari kesepuluh oospora dipanen dan diperoleh hasil 2,1x103 oospora/ml setelah dihitung dengan
menggunakan Malassez hemocytometer. Oospora berbentuk bulat mempunyai dinding yang jelas dan lapisan halus (Gambar 5). Secara normal dalam pertumbuhannya L. giganteum membutuhkan unsur karbon, nitrogen dan mineral serta vitamin. Untuk dapat aktif memproduksi oospora dalam media cair yang digunakan untuk pertumbuhan dibutuhkan sterol, kalsium dan asam lemak tak jenuh. Sterol akan merubah pertumbuhan vegetatif menjadi pertumbuhan reproduktif. Sumber sterol dapat berasal dari minyak sayur, minyak jagung ataupun minyak ga ndum dan ketiga sumber sterol ini yang sangat optimum dalam memproduksi oospora (Kerwin et al. 1986). Oospora dapat dihasilkan dan dapat bertahan lama dengan memberikan asam lemak dalam media pertumbuhannya khususnya unsur trigliserida. Jumlah oospora yang diproduksi dipengaruhi suhu, pH, nutrisi, salinitas, cahaya ataupun komponen organik. Dalam penelitian ini oospora yang dihasilkan sedikit, hal ini kemungkinan disebabkan oleh faktor sterol yang digunakan ataupun asam lemaknya kurang optimal sehingga berpengaruh dalam proses oosporogenesis. Menurut Kerwin et al. (1986) bahwa dalam produksi oospora hasil akan optimum apabila jumlah sterol yang ditambahkan cukup besar yaitu 60 mg/lt dan diproduksi menggunakan fermentor. Tipe dan konsentrasi asam lemak yang digunakan juga berpengaruh dalam proses oosporogenesis. Asam lemak kemungkinan mempengaruhi proses fisiologi yang berkaitan dengan terjadinya oosporogenesis. Asam lemak tergabung dalam golongan fospolipid yang mungkin berpengaruh dalam aktivitas pengikatan antara membran sel dengan enzim adenil siklase yang diketahui terlibat dalam merangsang terjadinya proses oosporogenesis. Kandungan fospolipid juga berpengaruh dalam fusi antara anteridia dan oogonia , menghambat terjadinya
gametangia sehingga menyebabkan terjadinya kegagalan dalam pembentukkan oospora.
Vegetables oil kaya akan asam oleic, linoleic dan linolenic, ketika ditambahkan kholesterol, yang mana keduanya cocok sebagai sumber asam lemak untuk produksi oospora yang aktif dalam media cair. Menurut Kerwin e t al. (1986) bahwa asam linolenic yang terkandung dalam ekstrak hemp seed mendekati 60%, sehingga apabila minyak ini ditambahkan pada media dasar yang telah ditambah kolesterol akan sangat berpengaruh dalam memproduksi oospora. Selain itu dalam proses oosporogenesis juga dibutuhkan adanya unsur kalsium dan magnesium. Menurut Brey (1985) dengan menggunakan media biakan yang sama oospora yang dihasilkan 5,0 x 103 dan Kerwin et al. (1983) menggunakan medium padat yang berisi PYG dan ditambah suplemen kolesterol dan lesitin mampu menghasilkan oospora sejumlah 4,1x105/10 cm diameter petri.
Gambar 5. Oospora perbesaran 10x
Oospora mampu bertahan hidup dan bersifat dorman (spora istirahat) serta stabil, dapat bertahan terhadap kondisi lingkungan yang kurang baik, tahan terhadap kekeringan dan mampu bertahan sampai 7 tahun (Kerwin 2000). Pada
kondisi lingkungan yang tepat, oospora akan ber kecambah dan menghasilkan zoospora.
KESIMPULAN Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa :
1. Media biakan yang terdiri dari Media PYG yaitu media yang berisi pepton, yeast ekstrak dan glukosa yang kemudian dipindahkan kemedia yang mengandung sumplemen vegetable oil serta dipindahkan ke media air bebas ion mampu menghasilakn zoospora sebanyak 15 x 107 zoospora/ml.
2. Media cair yang berisi 1,25 gr pepton, 1,25 gr ardamin, 3 gr glukosa, 0,05 gr lesitin, 0,025 mg kholesterol, 0,075 CaCl2.2H2O dan 0,15 gr Mg. Cl2.6H2O dan
media yang mengandung 2,8g/lt yeast ekstrak, 2,4 gr glukosa, 3,2 gr/lt tepung gandum, 300 mg/lt cottonseed oil, 100 ml ekstrak cotton seed flour, 0,15 gr. CaCl2.2H2O dan 0,15 gr Mg.Cl2.6H2O menghasilkan oospora sebanyak 2,1x103