• Tidak ada hasil yang ditemukan

3.4 Cara Pengambilan Sampel Penelitian

3.5.3 Pengolahan Sampel Darah

Serum yang tersimpan akan dicairkan pada suhu ruangan sekitar lima

menit dan akan dilakukan pemeriksaan assay VEGF. Pemeriksaan tersebut adalah suatu pemeriksaan kuantitatif dengan menggunakan teknik Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Sebuah antibodi monoklonal spesifik terhadap VEGF telah dilekatkan pada sumur-sumur dalam microplate. Standar dan sampel dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang tersedia dengan

menggunakan pipet mikro dan keberadaan VEGF akan diikat dengan antibodi

imobilisasi. Setelah dilakukan teknik pencucian untuk membuang

substrat-substrat yang tidak berikatan, sebuah antibodi poliklonal VEGF yang berikatan

dengan enzim ditambahkan pada sumur-sumur tersebut. Setelah dilakukan

pencucian kembali, untuk membuang reagen antibodi-enzim yang tidak berikatan,

sebuah larutan substrat ditambahkan pada sumur-sumur sehingga menimbulkan

reaksi yang mengeluarkan warna. Warna yang muncul akan sesuai dengan

proporsi keberadaan VEGF yang terikat pada tahap awal. Perkembangan warna

dihentikan dan intensitas warna tersebut diukur dengan menggunakan alat

a. Langkah-langkah Pengolahan Sampel Darah:

1) Persiapan Buffer, Biotin, Streptaviridin, Standar VEGF-A

Konsentrat buffer sebaiknya berada dalam temperatur ruangan dan

sebaiknya dilarutkan sebelum melakukan prosedur pemeriksaan. Jika

terbentuk kristal di dalam konsentrat buffer, dapat dihangatkan sedikit

hingga terlarut secara menyeluruh.

Buffer pencuci

Dituangkan 50 ml konsentrat buffer pencuci (20x) ke dalam tabung

1000 ml. Dilarutkan hingga mencapai volume 1000 ml dengan air

de-ionisasi atau akuades, dicampurkan perlahan untuk menghindari

pembentukan busa. Kemudian dipindahkan ke dalam botol pencuci

dan disimpan pada temperatur 2o hingga 25oC. Larutan buffer pencuci

ini (1x) stabil selama 30 hari.

Buffer penguji

Dituangkan semua isi (5 ml) kosentrat buffer penguji (20x) ke dalam

tabung 100 ml, dan dilarutkan hingga mencapai volume 100 ml dengan

akuades. Kemudian dicampurkan perlahan untuk menghindari

pembentukan busa dan disimpan pada temperatur 2o hingga 8oC.

Konjugat Biotin

Larutan konjugat Biotin harus digunakan dalam waktu 30 menit

setelah dilakukan pengenceran. Dibuatlah larutan 1:100 dari konsentrat

konjugat Biotin dengan Buffer penguji (1x) dalam tabung plastik

bersih. (0,06 ml konsentrat ditambahkan 5,94 ml buffer penguji atau

0,12 ml konsentrat ditambahkan 11,88 ml buffer penguji).

Streptavidin-HRP

Larutan Streptavidin HRP harus digunakan dalam waktu 30 menit

setelah dilakukan pengenceran. Kemudian dibuat larutan 1:100 dari

konsentrat Streptavidin-HRP dengan Buffer penguji (1x) dalam tabung

plastik bersih. (0,06 ml konsentrat ditambahkan 5,94 ml buffer penguji

atau 0,12 ml konsentrat ditambahkan 11,88 ml buffer penguji).

Standar VEGF-A manusia

Rekonstitusi VEGF-A manusia standar dengan menambahkan

akuades. Volume rekonstitusi ditentukan dari label tabung standar.

Digoyangkan atau dicampurkan perlahan untuk memastikan proses

pelarutan yang homogen (konsentrasi standar rekonstitusi = 2 ng/ml).

Rekonstitusikan standar selama 30 menit, dan dicampurkan dengan

baik sebelum melakukan pelarutan berikutnya. Setelah digunakan,

mikro atau secara alternatif pada tabung lain. Kemudian diambil

dengan menggunakan pipet sejumlah 225µl pengencer sampel pada setiap tabung. Setelah itu ambil sebanyak 225µl standar ter-rekonstitusi (2ng/ml) dengan menggunakan pipet ke dalam tabung

pertama, berikan tanda S1 dan kemudian dicampurkan (konsentrasi

1ng/ml), kemudian dengan pipet sejumlah 225µl larutan S1 ke dalam tabung kedua, berikan label S2 dan kemudian dicampurkan.

Selanjutnya dilakukan dilusi serial lima kali lagi sehingga dapat

membentuk kurva standar.Pengencer standar digunakan sebagai

2) Prosedur pengujian:

a) Ditentukan jumlah sumur yang akan dibutuhkan untuk melakukan

pengujian (jumlah sampel ditambahkan dengan blanko dan standar.

Setiap sampel, standar, blanko, dan sampel kontrol sebaiknya diuji

sebagai duplo. Dilepaskan sumur-sumur yang tidak dipakai dari

pemegang dan simpan dalam kantong aluminium dengan

pengering yang telah disediakan pada temperatur 2o-8o dengan

pengemasan ketat.

b) Sumur mikro dicuci dua kali dengan sekitar 400µl, buffer pencuci pada setiap sumur dengan aspirasi berulang di antara pencucian.

Didiamkan buffer pencuci selama sekitar 10-15 detik sebelum

aspirasi. Perhatikan ujung pipet agar tidak menggores permukaan

sumur mikro. Dikosongkan sumur dan ketukkan perlahan sumur

mikro pada handuk kertas/ kertas penghisap untuk menghilangkan

buffer pencuci yang berlebihan. Digunakan sumur mikro segera

setelah pencucian. Cara lain: sumur mikro dapat diletakkan terbalik

pada handuk kertas/tissue penghisap tidak lebih dari 15 menit.

Sumur mikro tidak boleh mengalami pengeringan.

c) Pengenceran standar:

Ditambahkan 100 µl pengencer sampel duplo terhadap semua sumur standar. Pipetkan 100 µl larutan standar (2000 pg/ml) duplo pada sumur A1 dan A2. Dicampurkan kandungan sumur A1 dan

= 1000 pg/ml), dan pindahkan 100µl ke dalam tabung B1 dan B2. Dilakukan proses pengenceran serial sebanyak lima kali,

membentuk dua baris standar VEGF-A standar dengan konsentrasi

1000 hingga 15,6 pg/ml.

d) Ditambahkan 100 µl pengencer sampel duplo pada sumur kosong (blanko).

e) Ditambahkan 50 µl pengencer sampel pada sumur sampel.

f) Ditambahkan 50 µl sampel-sampel secara duplo pada sumur sampel.

g) Ditutup dengan lapisan penutup dan inkubasikan pada temperatur

ruangan 18-25oC selama dua jam pada pengaduk plat mikro

dengan 100 rpm.

h) Dipersiapkan konjugat biotin.

i) Dilepaskan lapisan penutup. Cucilah sumur mikro sebanyak enam

kali seperti pada tahap kedua dari protokol pengujian.

j) Ditambahkan 100 µl konjugat biotin.

k) Ditutup dengan lapisan penutup dan inkubasikan pada temperatur

ruangan 18-25oC selama satu jam pada pengaduk plat mikro

dengan 100 rpm.

l) Dipersiapkan Streptavidin-HRP.

m) Dilepaskan lapisan penutup. Cucilah sumur mikro sebanyak enam

n) Ditambahkan 100 µl Streptavidin-HRP yang telah diencerkan pada semua sumur, termasuk sumur blanko.

o) Ditutup dengan lapisan penutup dan inkubasikan pada temperatur

ruangan 18-25oC selama satu jam pada pengaduk plat mikro

dengan 100 rpm.

p) Dilepaskan lapisan penutup. Cucilah sumur mikro sebanyak enam

kali seperti pada tahap kedua dari protokol pengujian.

q) Dimasukkan dengan menggunakan pipet sebanyak 100 µl larutan substrat TMB pada semua sumur.

r) Ditutup dengan lapisan penutup dan inkubasikan pada temperatur

ruangan 18-25oC selama 30 menit. Dihindari paparan terhadap

cahaya.

s) Pengembangan warna pada plat sebaiknya terus diperhatikan dan

reaksi substrat distop sebelum tidak dapat diukur lagi. Penentuan

waktu yang ideal untuk setiap pengembangan warna harus

dilakukan secara individual terhadap setiap pengujian.

t) Direkomendasikan untuk menambahkan larutan stop ketika standar

tertinggi telah berwarna biru gelap. Cara lain dengan menggunakan

reader ELISA pada 620 nm. Reaksi substrat sebaiknya distop

ketika standar 1 mencapai OD 0,9 – 0,95.

u) Stop reaksi enzimatik dengan memberikan 100µl larutan stop secara cepat pada setiap sumur. Hasil harus dibaca segera setelah

larutan stop diberikan atau dalam satu jam jika disimpan pada suhu

2-8oC dalam keadaan gelap.

v) Pembacaan absorbansi dilakukan di setiap sumur mikro pada

spektrofotometer dengan menggunakan 450 nm sebagai gelombang

cahaya primer (dapat juga menggunakan 610 - 650nm).

Alat Ukur : Pengukuran dilakukan dengan menggunakan ELISA analyser Chemwell 2910 (Awareness Technology, Inc.)

Hasil Ukur : Hasil ukur akan didapat dalam satuan pg/ml.

3) Prinsip Pengujian :

Coating antibody anti-VEGF-A manusia ditempelkan pada sumur-sumur mikro.

Keberadaan VEGF-A manusia pada sampel atau standar akan berikatan dengan antibodi yang telah ditempelkan pada sumur-sumur mikro.

Setelah dilakukan inkubasi, komponen-komponen biologis dibuang dengan melakukan tahap pencucian. Antibodi terhadap VEGF-A manusia yang telah dikonjugasikan dengan biotin ditambahkan dan akan berikatan dengan VEGF-A yang telah ditangkap oleh antibodi yang telah ditambahkan pertama kali.

Setelah dilakukan inkubasi, antibodi anti-VEGF-A manusia yang terkonjugasi dengan biotin yang tidak berikatan akan dibuang dengan tahap pencucian. Streptavidin-HRP ditambahkan dan berikatan pada antibodi anti-VEGF-A manusia yang terkonjugasi dengan biotin.

Setelah dilakukan inkubasi, streptavidin-HRP yang tidak berikatan dibuang dengan tahap pencucian, kemudian larutan substrat reaktif terhadap HRP ditambahkan pada sumur-sumur

pemeriksaan.

Reaksi antara substrat reaktif yang berikatan dengan HRP akan menghasilkan produk berwarna berhubungan dengan proporsinya terhadap keberadaan VEGF-A manusia yang terkandung dalam sampel atau standar. Reaksi ini dihentikan dengan menambahkan larutan bersifat asam. Kandungan VEGF-A didapat dengan mengukur absorbansi pada 450 nm. Kurva standar dibuat dari 7 standar VEGF-A dengan beberapa pengenceran, sehingga kadar VEGF-A sampel dapat ditentukan.

Dokumen terkait