3.4 Cara Pengambilan Sampel Penelitian
3.5.3 Pengolahan Sampel Darah
Serum yang tersimpan akan dicairkan pada suhu ruangan sekitar lima
menit dan akan dilakukan pemeriksaan assay VEGF. Pemeriksaan tersebut adalah suatu pemeriksaan kuantitatif dengan menggunakan teknik Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Sebuah antibodi monoklonal spesifik terhadap VEGF telah dilekatkan pada sumur-sumur dalam microplate. Standar dan sampel dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang tersedia dengan
menggunakan pipet mikro dan keberadaan VEGF akan diikat dengan antibodi
imobilisasi. Setelah dilakukan teknik pencucian untuk membuang
substrat-substrat yang tidak berikatan, sebuah antibodi poliklonal VEGF yang berikatan
dengan enzim ditambahkan pada sumur-sumur tersebut. Setelah dilakukan
pencucian kembali, untuk membuang reagen antibodi-enzim yang tidak berikatan,
sebuah larutan substrat ditambahkan pada sumur-sumur sehingga menimbulkan
reaksi yang mengeluarkan warna. Warna yang muncul akan sesuai dengan
proporsi keberadaan VEGF yang terikat pada tahap awal. Perkembangan warna
dihentikan dan intensitas warna tersebut diukur dengan menggunakan alat
a. Langkah-langkah Pengolahan Sampel Darah:
1) Persiapan Buffer, Biotin, Streptaviridin, Standar VEGF-A
Konsentrat buffer sebaiknya berada dalam temperatur ruangan dan
sebaiknya dilarutkan sebelum melakukan prosedur pemeriksaan. Jika
terbentuk kristal di dalam konsentrat buffer, dapat dihangatkan sedikit
hingga terlarut secara menyeluruh.
Buffer pencuci
Dituangkan 50 ml konsentrat buffer pencuci (20x) ke dalam tabung
1000 ml. Dilarutkan hingga mencapai volume 1000 ml dengan air
de-ionisasi atau akuades, dicampurkan perlahan untuk menghindari
pembentukan busa. Kemudian dipindahkan ke dalam botol pencuci
dan disimpan pada temperatur 2o hingga 25oC. Larutan buffer pencuci
ini (1x) stabil selama 30 hari.
Buffer penguji
Dituangkan semua isi (5 ml) kosentrat buffer penguji (20x) ke dalam
tabung 100 ml, dan dilarutkan hingga mencapai volume 100 ml dengan
akuades. Kemudian dicampurkan perlahan untuk menghindari
pembentukan busa dan disimpan pada temperatur 2o hingga 8oC.
Konjugat Biotin
Larutan konjugat Biotin harus digunakan dalam waktu 30 menit
setelah dilakukan pengenceran. Dibuatlah larutan 1:100 dari konsentrat
konjugat Biotin dengan Buffer penguji (1x) dalam tabung plastik
bersih. (0,06 ml konsentrat ditambahkan 5,94 ml buffer penguji atau
0,12 ml konsentrat ditambahkan 11,88 ml buffer penguji).
Streptavidin-HRP
Larutan Streptavidin HRP harus digunakan dalam waktu 30 menit
setelah dilakukan pengenceran. Kemudian dibuat larutan 1:100 dari
konsentrat Streptavidin-HRP dengan Buffer penguji (1x) dalam tabung
plastik bersih. (0,06 ml konsentrat ditambahkan 5,94 ml buffer penguji
atau 0,12 ml konsentrat ditambahkan 11,88 ml buffer penguji).
Standar VEGF-A manusia
Rekonstitusi VEGF-A manusia standar dengan menambahkan
akuades. Volume rekonstitusi ditentukan dari label tabung standar.
Digoyangkan atau dicampurkan perlahan untuk memastikan proses
pelarutan yang homogen (konsentrasi standar rekonstitusi = 2 ng/ml).
Rekonstitusikan standar selama 30 menit, dan dicampurkan dengan
baik sebelum melakukan pelarutan berikutnya. Setelah digunakan,
mikro atau secara alternatif pada tabung lain. Kemudian diambil
dengan menggunakan pipet sejumlah 225µl pengencer sampel pada setiap tabung. Setelah itu ambil sebanyak 225µl standar ter-rekonstitusi (2ng/ml) dengan menggunakan pipet ke dalam tabung
pertama, berikan tanda S1 dan kemudian dicampurkan (konsentrasi
1ng/ml), kemudian dengan pipet sejumlah 225µl larutan S1 ke dalam tabung kedua, berikan label S2 dan kemudian dicampurkan.
Selanjutnya dilakukan dilusi serial lima kali lagi sehingga dapat
membentuk kurva standar.Pengencer standar digunakan sebagai
2) Prosedur pengujian:
a) Ditentukan jumlah sumur yang akan dibutuhkan untuk melakukan
pengujian (jumlah sampel ditambahkan dengan blanko dan standar.
Setiap sampel, standar, blanko, dan sampel kontrol sebaiknya diuji
sebagai duplo. Dilepaskan sumur-sumur yang tidak dipakai dari
pemegang dan simpan dalam kantong aluminium dengan
pengering yang telah disediakan pada temperatur 2o-8o dengan
pengemasan ketat.
b) Sumur mikro dicuci dua kali dengan sekitar 400µl, buffer pencuci pada setiap sumur dengan aspirasi berulang di antara pencucian.
Didiamkan buffer pencuci selama sekitar 10-15 detik sebelum
aspirasi. Perhatikan ujung pipet agar tidak menggores permukaan
sumur mikro. Dikosongkan sumur dan ketukkan perlahan sumur
mikro pada handuk kertas/ kertas penghisap untuk menghilangkan
buffer pencuci yang berlebihan. Digunakan sumur mikro segera
setelah pencucian. Cara lain: sumur mikro dapat diletakkan terbalik
pada handuk kertas/tissue penghisap tidak lebih dari 15 menit.
Sumur mikro tidak boleh mengalami pengeringan.
c) Pengenceran standar:
Ditambahkan 100 µl pengencer sampel duplo terhadap semua sumur standar. Pipetkan 100 µl larutan standar (2000 pg/ml) duplo pada sumur A1 dan A2. Dicampurkan kandungan sumur A1 dan
= 1000 pg/ml), dan pindahkan 100µl ke dalam tabung B1 dan B2. Dilakukan proses pengenceran serial sebanyak lima kali,
membentuk dua baris standar VEGF-A standar dengan konsentrasi
1000 hingga 15,6 pg/ml.
d) Ditambahkan 100 µl pengencer sampel duplo pada sumur kosong (blanko).
e) Ditambahkan 50 µl pengencer sampel pada sumur sampel.
f) Ditambahkan 50 µl sampel-sampel secara duplo pada sumur sampel.
g) Ditutup dengan lapisan penutup dan inkubasikan pada temperatur
ruangan 18-25oC selama dua jam pada pengaduk plat mikro
dengan 100 rpm.
h) Dipersiapkan konjugat biotin.
i) Dilepaskan lapisan penutup. Cucilah sumur mikro sebanyak enam
kali seperti pada tahap kedua dari protokol pengujian.
j) Ditambahkan 100 µl konjugat biotin.
k) Ditutup dengan lapisan penutup dan inkubasikan pada temperatur
ruangan 18-25oC selama satu jam pada pengaduk plat mikro
dengan 100 rpm.
l) Dipersiapkan Streptavidin-HRP.
m) Dilepaskan lapisan penutup. Cucilah sumur mikro sebanyak enam
n) Ditambahkan 100 µl Streptavidin-HRP yang telah diencerkan pada semua sumur, termasuk sumur blanko.
o) Ditutup dengan lapisan penutup dan inkubasikan pada temperatur
ruangan 18-25oC selama satu jam pada pengaduk plat mikro
dengan 100 rpm.
p) Dilepaskan lapisan penutup. Cucilah sumur mikro sebanyak enam
kali seperti pada tahap kedua dari protokol pengujian.
q) Dimasukkan dengan menggunakan pipet sebanyak 100 µl larutan substrat TMB pada semua sumur.
r) Ditutup dengan lapisan penutup dan inkubasikan pada temperatur
ruangan 18-25oC selama 30 menit. Dihindari paparan terhadap
cahaya.
s) Pengembangan warna pada plat sebaiknya terus diperhatikan dan
reaksi substrat distop sebelum tidak dapat diukur lagi. Penentuan
waktu yang ideal untuk setiap pengembangan warna harus
dilakukan secara individual terhadap setiap pengujian.
t) Direkomendasikan untuk menambahkan larutan stop ketika standar
tertinggi telah berwarna biru gelap. Cara lain dengan menggunakan
reader ELISA pada 620 nm. Reaksi substrat sebaiknya distop
ketika standar 1 mencapai OD 0,9 – 0,95.
u) Stop reaksi enzimatik dengan memberikan 100µl larutan stop secara cepat pada setiap sumur. Hasil harus dibaca segera setelah
larutan stop diberikan atau dalam satu jam jika disimpan pada suhu
2-8oC dalam keadaan gelap.
v) Pembacaan absorbansi dilakukan di setiap sumur mikro pada
spektrofotometer dengan menggunakan 450 nm sebagai gelombang
cahaya primer (dapat juga menggunakan 610 - 650nm).
Alat Ukur : Pengukuran dilakukan dengan menggunakan ELISA analyser Chemwell 2910 (Awareness Technology, Inc.)
Hasil Ukur : Hasil ukur akan didapat dalam satuan pg/ml.
3) Prinsip Pengujian :
Coating antibody anti-VEGF-A manusia ditempelkan pada sumur-sumur mikro.
Keberadaan VEGF-A manusia pada sampel atau standar akan berikatan dengan antibodi yang telah ditempelkan pada sumur-sumur mikro.
Setelah dilakukan inkubasi, komponen-komponen biologis dibuang dengan melakukan tahap pencucian. Antibodi terhadap VEGF-A manusia yang telah dikonjugasikan dengan biotin ditambahkan dan akan berikatan dengan VEGF-A yang telah ditangkap oleh antibodi yang telah ditambahkan pertama kali.
Setelah dilakukan inkubasi, antibodi anti-VEGF-A manusia yang terkonjugasi dengan biotin yang tidak berikatan akan dibuang dengan tahap pencucian. Streptavidin-HRP ditambahkan dan berikatan pada antibodi anti-VEGF-A manusia yang terkonjugasi dengan biotin.
Setelah dilakukan inkubasi, streptavidin-HRP yang tidak berikatan dibuang dengan tahap pencucian, kemudian larutan substrat reaktif terhadap HRP ditambahkan pada sumur-sumur
pemeriksaan.
Reaksi antara substrat reaktif yang berikatan dengan HRP akan menghasilkan produk berwarna berhubungan dengan proporsinya terhadap keberadaan VEGF-A manusia yang terkandung dalam sampel atau standar. Reaksi ini dihentikan dengan menambahkan larutan bersifat asam. Kandungan VEGF-A didapat dengan mengukur absorbansi pada 450 nm. Kurva standar dibuat dari 7 standar VEGF-A dengan beberapa pengenceran, sehingga kadar VEGF-A sampel dapat ditentukan.