B. Metode Penelitian
2. Pengujian Aktivitas Antimikroba sebagai Seleksi untuk
Bakteriosin
a. Pengaruh Netralisasi Senyawa Antimikroba terhadap Bakteri Uji Sensitif dengan Metode Kontak (Rahayu, 2000)
Disiapkan MRSB sebanyak 60 ml dalam erlenmeyer yang telah disterilisasi. Setelah itu diinokulasikan sebanyak 3 ose dari kultur BAL yang akan diuji dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Selanjutnya kultur yang diperoleh disentrifugasi pada 8000 rpm, 4oC selama 15 menit sehingga menghasilkan supernatan. Kemudian Supernatan dibagi menjadi 2 bagian, yang pertama supernatan disaring dengan milipore 0.22 µm untuk menghasilkan supernatan bebas sel. Kedua, supernatan dinetralkan pHnya hingga 6.5 dengan NaOH 1 N untuk menghilangkan pengaruh asam organik yang dihasilkan BAL. Sebelum dinetralkan, dilakukan pengukuran pH awal dari tiap supernatan isolat BAL.
Selanjutnya, sebanyak 10 ml dari masing-masing supernatan dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril dan dilakukan duplo sehingga diperoleh dua tabung supernatan bebas sel dan dua tabung supernatan netral bebas sel. Kemudian ke dalam tiap tabung dimasukkan kultur bakteri uji yang diketahui sensitif terhadap senyawa antimikroba pada tahap 1. Bakteri uji tersebut berumur 24 jam dengan konsentrasi ± 105 sel per ml. Kemudian tabung diinkubasi selama 8 jam pada suhu 37oC. Jumlah bakteri uji dalam tabung tersebut dihitung pada waktu kontak 0 dan 8 jam waktu inkubasi dengan menggunakan metode hitungan cawan. Selanjutnya cawan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam. Selanjutnya akan dilakukan perhitungan pertumbuhan relatif dinyatakan sebagai Nt/N0 dimana Nt adalah log dari jumlah koloni setelah kontak 8 jam dan N0 adalah log dari jumlah koloni pada waktu kontak 0 jam. Perhitungan koloni didasarkan pada Standard Plate Count atau SPC (Harrigan, 1998). Terakhir, nilai perubahan logaritma bakteri uji dalam supernatan tiap isolat akan dibandingkan dengan
pertumbuhan bakteri uji sebagai kontrol, menggunakan pengujian statistik menggunakan program SPSS yaitu ANOVA yang dilanjutkan dengan uji Duncan.
Dalam metode ini, diperlukan kontrol untuk mengukur tingkat pertumbuhan bakteri uji di dalam MRSB yang tidak ditumbuhkan BAL. Isolat yang dianggap berpotensi menghasilkan bakteriosin adalah isolat dengan supernatan netral yang mampu menekan pertumbuhan bakteri uji.
Cara perhitungan koloni berdasarkan SPC dengan aturan bahwa cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 25 - 250
N = jumlah koloni pada cawan ( n1 + 0.1 n2) x d Keterangan :
n1 = jumlah cawan pada pengenceran pertama n2 = jumlah cawan pada pengenceran kedua d = pengenceran pada cawan pertama
b. Penentuan Waktu Inkubasi Berdasarkan Kurva Pertumbuhan
(Rattanachaikunsopon dan Phumkhachorn, 2006) Tahap ini bertujuan untuk mengetahui fase-fase pertumbuhan
tiap isolat khususnya akhir fase logaritmik (eksponensial) dan awal fase stasioner sebagai dasar penentuan lamanya waktu inkubasi kultur BAL. Waktu Inkubasi berpengaruh terhadap jenis dan jumlah senyawa antimikroba yang dihasilkan BAL. Isolat yang digunakan pada tahap ini adalah isolat yang lolos seleksi dari tahap pengujian dengan metode kontak.
Masing-masing bakteri ditumbuhkan pada 10 ml MRSB kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Kultur uji ini diinokulasikan sebanyak 2% dari media cair yaitu 3 ml ke dalam 150 ml MRSB secara aseptik. Masing-masing suspensi bakteri dalam
erlenmeyer diamati pertumbuhan sel dan dilakukan pengukuran Optical Density(OD) berdasarkan nilai Absorbansi setiap 1 jam hingga jam ke- 9 kemudian setiap 2 jam hingga jam ke-21. Pengukuran dilakukan hingga diperoleh nilai OD konstan menggunakan spektrofotometer UV- VIS pada panjang gelombang 660 nm. Pengenceran dilakukan jika OD mendekati 1 atau lebih dari 1 untuk menghindari penyimpangan data dikarenakan sampel yang terlalu pekat. Nilai Absorbansi (A) adalah nilai absorbansi yang terukur pada alat sedangkan Optical Density(OD) adalah Nilai Absorbansi (A) dikalikan dengan faktor pengenceran.
OD = A x FP dimana OD : Optical Density A : Nilai Absorbansi FP : Faktor Pengenceran
c. Pengaruh Waktu Inkubasi terhadap Aktivitas Antimikroba
Tahap ini dilakukan dengan metode difusi agar dan metode kontak menggunakan supernatan yang telah dinetralkan untuk mengetahui keberadaan senyawa antimikroba selain asam organik. Pada tahap ini kultur BAL yang telah diketahui kurva pertumbuhannya, diinkubasi berdasarkan waktu yang diperlukan oleh tiap isolat untuk mencapai fase yang berkaitan erat dengan sintesis senyawa antimikroba dalam fase pertumbuhannya.
Pada metode difusi agar dalam tahap ini, diperlukan proses pemisahan badan sel untuk pengujian supernatan bebas sel yang mengandung senyawa antimikroba. Isolat Bal diremajakan dalam 10 ml MRSB selama 24 jam kemudian diinokulasikan ke dalam 50 ml MRSB dan diinkubasi sesuai dengan jangka waktu yang diperlukan kultur tersebut untuk mencapai fase stasioner dari kurva pertumbuhannya. Supernatan bebas sel diperoleh dengan cara mensentrifugasi kultur cair dengan kecepatan 8000 rpm, 4oC selama 15 menit.
Selanjutnya supernatan yang diperoleh dinetralkan dan disaring dengan milipore 0.22 µm. Filtrat yang dihasilkan kemudian diuji
aktivitasnya terhadap bakteri uji dengan metode difusi agar namun pada tahap ini jumlah bakteri uji yang terkandung dalam sumur agar adalah 106 sel per ml dan supernatan yang dimasukkan ke dalam sumur sebanyak 50 µl. Bakteri uji yang digunakan hanya gram positif yaitu Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, dan Staphylococcus aureus. Zona bening (Zona penghambatan) yang terbentuk menunjukkan adanya penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri uji oleh supernatan. Diameter zona penghambatan (mm) diukur dengan jangka sorong sebanyak dua kali pada posisi yang berbeda dan dirata-ratakan
Pada tahap ini juga dilakukan metode kontak. Isolat BAL diremajakan dalam 10 ml media cair selama 24 jam kemudian diinokulasikan ke dalam 50 ml MRSB dan diinkubasi sesuai dengan jangka waktu yang diperlukan kultur tersebut untuk mencapai fase stasioner dari kurva pertumbuhannya. Supernatan bebas sel diperoleh dengan cara mensentrifugasi kultur cair dengan kecepatan 8000 rpm, 4oC selama 15 menit (Kim et al., 2000). Selanjutnya supernatan yang diperoleh dinetralkan dan disaring dengan milipore 0.22 µm. Filtrat yang dihasilkan diuji aktivitasnya hanya terhadap bakteri uji L. monocytogenesdengan metode kontak. Hasil metode kontak pada tahap ini juga dianalisis dengan pengujian statistik ANOVA yang dilanjutkan dengan uji Duncan menggunakan program SPSS untuk dibandingkan dengan kontrol.
d. Konfirmasi Pengujian Bakteriosin
Tahap ini dilakukan untuk mengkonfirmasi keberadaan bakteriosin dengan mengendapakan molekul protein yang terlarut dalam media pertumbuhan MRSB. Kultur yang berpotensi menghasilkan bakteriosin berdasarkan pengujian dengan metode kontak, disegarkan selama 24 jam kemudian dipindahkan sebanyak 2% ke dalam 60 ml MRSB dalam erlenmeyer dan diinkubasi kembali selama waktu yang ditentukan berdasarkan awal fase stasionernya. Kemudian disentrifugasi 8000 rpm selama 15 menit dan diambil supernatannya sebanyak 50 ml. Supernatan bebas sel tersebut
dinetralisasi (NaOH 1 N) dan disterilisasi menggunakan membran 0.22 µm dan dilanjutkan ke tahap presipitasi dengan menambahkan ammonium sulfat (51.6 g/100 ml supernatan) dan diaduk selama 2 jam pada suhu 4oC.
Jika terdapat molekul protein bakteriosin maka protein tersebut akan terpresipitasi (mengendap) selanjutnya dipisahkan dari larutan dengan sentrifugasi pada 18.000 rpm selama 30 menit pada suhu 4oC. Endapan yang dihasilkan selanjutnya dilarutkan dalam 18 ml buffer sitrat fosfat (50 mM; pH 5.0). Kemudian larutan protein dalam buffer diuji dengan metode difusi agar terhadap bakteri uji L. monocytogenes, B.cereus, dan S. aureus.
