METODOLOGI PENELITIAN
Tahap 3 Pengujian Biologis
Pengujian biologis untuk melihat pengaruh pemberian minuman ekstrak bubuk daun kumis kucing dan bunga kenop terpilih terhadap proliferasi sel limfosit secara in vivo, in vitro dan in vivo-in vitro menggunakan limfosit hewan. Hewan percobaan yang digunakan adalah tikus jantan spesies Rattus novergicus strain Sprague-Dawley
berumur kurang lebih 1.5 bulan dengan berat rata-rata antara 150-200 g sebanyak 35 ekor. Kandang yang digunakan adalah kandang pemeliharaan biasa yang ditempatkan dalam ruangan dengan lama masa terang dan gelap masing- masing 12 jam. Komposisi ransum standar yang diberikan berdasarkan AOAC (1990) disajikan pada Lampiran 3. Prosedur pengujian secara rinci dijelaskan pada Gambar 5.
Pelaksanaan kegiatan dimulai dengan mempersiapkan 35 ekor tikus dan dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan dengan masing- masing kelompok berjumlah 7 ekor tikus. Perbedaan berat awal rata-rata tikus antar kelompok tidak lebih dari 5 g dan perbedaan dalam satu kelompok yang sama maksimal 10 g. Perlakuan percobaan dikelompokkan sebagai berikut:
Kelompok I : Tikus yang diberi minum aquades sebagai kontrol
Kelompok II : Tikus yang diberi minuman ekstrak bubuk daun kumis kucing dosis 0.4 g
Kelompok III : Tikus yang diberi minuman ekstrak bubuk daun kumis kucing dosis 0.8 g
Kelompok IV : Tikus yang diberi minuman ekstrak bubuk bunga kenop dosis 0.6 g Kelompok V : Tikus yang diberi minuman ekstrak bubuk bunga kenop dosis 1.2 g
Sebelum diberi perlakuan, tikus diadaptasikan terlebih dahulu dengan ransum standar dan diberi minum akuades secara ad libitum selama satu minggu. Pengukuran berat badan selama masa adaptasi dilakukan dua kali di awal dan di akhir masa adaptasi.
Percobaan dilakukan selama 8 minggu terhitung sejak selesai masa adaptasi dengan perlakuan minuman ekstrak bubuk daun kumis kucing dan bunga kenop. Dosis dasar untuk daun kumis kucing sebesar 6 g/hari/50 kg berat badan (BB) manusia dikonversikan ke dalam 70 kg BB manusia dan dikonversikan ke tikus (dikali 0.018) menjadi 0.15 g/hari/200 g BB. Sedangkan dosis untuk bunga kenop sebesar 9.5 g/hari/50 kg BB manusia yang dikonversikan ke dalam 70 kg BB dan dikonversikan ke tikus menjadi 0.24 g/hari/200 g BB.
Gambar 5 Tahapan pengujian proliferasi sel limfosit secara in vivo, in vitro dan
in vivo-in vitro
Hasil konversi ke tikus kemudian dijadikan dasar untuk membuat minuman perlakuan setiap hari. Dosis bubuk daun kumis kucing dan bunga kenop yang digunakan ada dua, yaitu dosis rendah (diberi kode 1) dan dosis
tinggi (diberi kode 2). Bubuk daun kumis kucing dosis rendah sebesar 0.4
g/ekor/hari 16.78 g/70 kg BB manusia sementara bubuk bunga kenop dosis rendah sebesar 0.6 g/ekor/hari setara dengan 13.35 g/70 kg BB manusia dan dosis tinggi sebesar 1.2 g/ekor/hari setara dengan 26.70 g/70 kg BB manusia. Penentuan dosis rendah dan dosis tinggi (0.4 dan 0.8 g untuk daun kumis kucing serta 0.6 dan 1.2 g untuk bunga kenop) berdasarkan hasil penelitian Aquarini (2006) pada limfosit manusia bahwa ekstrak daun kumis kuc ing dapat meningkatkan proliferasi limfosit sampai dosis 0.8 g dan bunga kenop pada dosis 1.2 g yang setara dengan 4 kali dosis normal pada manusia.
Perhitungan kesetaraan dosis bubuk daun kumis kucing dan bunga kenop berdasarkan Laurence dan Bacharach (1964) pada Lampiran 3 dan 4. Ekstrak bubuk daun kumis kucing dan bunga kenop dosis rendah dan tinggi disajikan pada Gambar 6.
(a) (b)
Gambar 6 Ekstrak bubuk minuman perlakuan; (a) daun kumis kucing dosis 0.4 dan 0.8 g bubuk/ekor/hari, (b) bunga kenop dosis 0.6 dan 1.2 g bubuk/ekor/hari
Proses pembuatan minuman perlakuan diawali dengan penimbangan sampel bubuk daun kumis kucing dan bunga kenop, kemudian diseduh dengan akuades mendidih dan didiamkan selama 5 menit. Kemudian disaring menggunakan kertas saring Whatman no. 41. Pemberian minuman dilakukan secara ad libitum
sebanyak 40 ml berdasarkan hasil rata-rata sisa minum tikus percobaan selama masa adaptasi. Penimbangan berat badan tikus dilakukan dua hari sekali, sisa ransum ditimbang setiap hari dan sisa minum diukur setiap hari. Diakhir masa perlakuan tikus dietanasi dan diambil limfanya untuk melihat proliferasi sel limfositnya. Secara rinci prosedur pengujian biologis, sebagai berikut:
a. Persiapan Pereaksi dan Media Kultur Pembuatan larutan NH4Cl 0.85%
Bubuk NH4Cl sebanyak 0.85 g dilarutkan dalam 100 ml aquabidest dan diaduk hingga homogen. Kemudian larutan tersebut disterilisasi dengan membran sterilisasi 0.20 µm.
Pembuatan Phosphate Buffer Saline (PBS)
Satu tablet PBS dilarutkan dalam 200 ml aquabidest dan diatur hingga mencapai pH 7.4. Kemudian larutan tersebut disterilisasi dengan membran sterilisasi 0.20 µm.
Pembuatan Indikator Tryphane Blue 0.20%
Bubuk Tryphane Blue sebanyak 0.05 g dilarutkan dalam 20 ml PBS dan diaduk hingga homogen.
Pembuatan Larutan Media RPMI-1640 sebagai Medium Kultur Sel Limfosit
Medium yang digunakan untuk kultur dan pemeliharaan sel limfosit adalah RPMI-1640 bubuk 16.2 g yang telah mengandung L-glutamin dan 0.25 mM HEPES. Komposisi lengkap medium RPMI-1640 dapat dilihat pada Lampiran 7. Bubuk ini dilarutkan dengan air bebas pirogen sehingga diperoleh 1 liter larutan medium RPMI-1640. Kemudian ditambahkan 2 g NaHCO3 dan 1% penisilin-streptomisin. Medium selanjutnya disterilisasi dingin dengan membran filter 0.20 µm dan digunakan sebagai medium pertumbuhan dan medium pencuci. Untuk medium kultur sel limfosit digunakan medium RPMI-1640 dengan penambahan
fetal bovine serum (FBS) 10% steril. Pembuatan medium dan tahap-tahap selanjutnya dalam isolasi sel limfosit dilakukan di dalam laminar flow yang steril dengan sistem pengaliran udara laminar. Sebelum digunakan, laminar flow ini disinari dahulu dengan sinar UV selama 15 menit.
Pembuatan MTT 0.5%
Bubuk MTT sebanyak 0.25 g dilarutkan dalam 50 ml PBS dan diaduk hingga homogen. Kemudian larutan disterilisasi dengan membran sterilisasi 0.20 µm.
Pembuatan Larutan HCl-isopropanol 0.04 N
HCl 37% p.a (pekat) dipipet sebanyak 23.4 µl dan ditambahkan 8.97 ml isopropanol p.a dan diaduk hingga homogen sehingga didapatkan larutan HCl-isopropanol 0.04 N. Larutan ini harus dibuat segar tiap akan digunakan.
Pembuatan Larutan Ekstrak Daun Kumis Kucing dan Bunga Kenop serta Mitogen
Persiapan ekstrak daun kumis kucing dan bunga kenop dilakukan dengan terlebih dahulu membuat larutan stock ekstrak. Larutan stock dibuat dengan cara mengekstraksi bubuk hasil pengeringan terbaik sesuai dengan dosis untuk pencegahan penyakit. Hasil ekstraksi disaring menggunakan saringan vakum dengan kertas saring Whatman No. 41. Setelah itu hasil ekstraksi dikeringbekukan dengan freeze dryer. Tabung freeze dryer ditimbang (X1), setelah itu hasil ekstrak dimasukkan ke dalam tabung freeze dryer selama 48 jam dan ditutup dengan aluminium foil untuk menghindari terjadinya oksidasi. Hasil freeze dryer (X2) ditimbang untuk menentukan rendemen. Re ndemen didapatkan dari perhitungan:
Berat bubuk sampel awal (g) = W1
Berat hasil freeze dryer (g) = X2 – X1 = W2 % 00 1 x W W %) basah (basis sampel Rendemen 1 2 =
Rendemen yang diperoleh, digunakan untuk membuat larutan stock ekstrak dan menjadi dasar untuk perhitungan dosis yang akan dimasukkan ke dalam kultur sel. Perhitungan selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 8. Pembuatan larutan stock ekstrak dan mitogen sebagai berikut :
Pembuatan larutan ekstrak (daun kumis kucing dan bunga kenop)
Sampel hasil freeze dryer sebanyak 1 g dilarutkan dengan medium RPMI-1640, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 5 ml. Medium RPMI-1640 ditambahkan sampai tanda tera, sehingga didapatkan larutan stock dengan konsentrasi 200 mg/ml. Pembuatan larutan LPS dan Con-A
Sebanyak 1 mg bubuk LPS atau Con-A dilarutkan dengan medium RPMI-1640, kemudian dimasukkan kedalam labu takar 5 ml. Medium RPMI-1640
ditambahkan sampai tanda tera, sehingga didapatkan larutan stock dengan konsentrasi 200 µ g/ml.
Pembuatan larutan Pokeweed
Sebanyak 0.005 g bub uk pokeweed dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan dilarutkan dengan medium RPMI-1640 sampai volume eppendorf 1 ml, sehingga didapatkan larutan stock dengan konsentrasi 500 µg/ml.
Pembuatan larutan ekstrak daun kumis kucing, bunga kenop dan mitogen (LPS, Con-A dan Pokeweed) yang akan digunakan dalam kultur sel limfosit, dilakukan dengan cara mengencerkan larutan stock dengan medium RPMI-1640 sesuai dengan konsentrasi yang akan diujikan pada kultur. Misalkan untuk membuat 1 ml (V2) ekstrak daun kumis kucing dengan konsentrasi C2=1.2 mg/ml (M2) maka larutan
stock ekstrak dengan konsentrasi 200 mg/ml (M1) yang harus diambil (V1) adalah:
V1 x M1 = V2 x M2
V1 x 200 mg/ml = 1 ml x 1.2 mg/ml V1 = 0.006015 ml = 6.015 µl ≈ 6 µ l
Jadi sebanyak 6 µl larutan stock ekstrak diambil dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1 ml dan ditambah dengan medium RPMI-1640 sampai tanda tera (994 µl larutan RPMI-1640).
b. Pengujian Proliferasi Sel Limfosit Secara in vivo, in vitro dan in vivo-in vitro
Isolasi Limfosit (Prangdimurti 1999)
Tikus dietanasi dengan cara dislokasio cervicalis, lalu diambil limfanya secara steril dan dicuci dalam cawan petri yang berisi RPMI-1640 steril. Kemudian limfa dipindahkan ke dalam cawan petri lain yang berisi 5 ml RPMI-1640 steril dan digerus untuk mendapatkan sel limfosit.
Setelah itu dimasukkan ke dalam tabung sentrifus steril 15 ml dan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, pelet sel diberi 2 ml NH4Cl 0.85% steril untuk melisis sel-sel darah merah selama tepat 2 menit dan segera ditambahkan 3 ml RPMI-1640. Suspensi sel kembali disentrifus 3000 rpm selama 10 menit. Endapan mengandung sel limfosit
sedangkan supernatan yang berisi sel darah merah yang lisis dibuang. Endapan sel limfosit dicuci kembali dengan RPMI-1640, kemudian diencerkan dengan 2 ml media RPMI-1640 dan di hitung jumlah sel yang hidup dengan bantuan pewarna
tryphan blue dan menggunakan hemasitometer.
Pengujian Proliferasi Sel Limfosit Secara in vivo dengan Penghitungan Jumlah Sel Hidup Menggunakan Metode Tryphan Blue (Doyle dan Griffiths 1997)
Uji viabilitas sel dengan metode pewarna tryphan bluedidasarkan atas adanya perbedaan permeabilitas membran antara sel hidup dan mati. Perhitunga n sel dilakukan dengan menggunakan hemasitometer. Suspensi sel dicampur dengan
tryphanblue dengan perbandingan 1:1 (50 µl suspensi sel ditambah 50 µl pewarna
tryphan blue). Sebanyak 50 µl campuran ditempatkan pada hemasitometer. Penghitungan dilakukan dengan perbesaran mikroskop 45 kali, sel yang hidup tampak terang, jernih dan berbentuk bulat sedangkan sel yang mati akan berwarna biru dan mengkerut.
Berdasarkan hasil perhitungan pada area 2 kotak besar (@ 16 kotak kecil) dapat ditetapkan jumlah sel yang hidup setiap milimeter suspensi dengan rumus:
sel/ml 10 x F x 2 V N= 4
Keterangan : N = jumlah sel/ml
V/2 = rata-rata jumlah sel terhitung dari dua bidang pandang F = faktor pengenceran (=2)
104 = jumlah sel per luas bidang pandang (1.0 mm x 1.0 mm x 0.1 mm)
Jumlah sel yang hidup merupakan jumlah sel limfosit tikus yang telah berproliferasi secara in vivo yang dinyatakan dengan nilai Indeks Stimulasi (IS). Selanjut nya sel limfosit yang diperoleh langsung dikultur untuk melihat kemampuan proliferasinya setelah inkubasi selama 3 hari sebagai uji in vitro dan in vivo-in vitro dengan penambahan ekstrak daun kumis kucing, bunga kenop dan mitogen sebagai stimulan. Menurut Tejasari (2000) untuk dapat digunakan sebagai
kultur sel, jumlah sel limfosit minimum dalam suspensi adalah 1x105 sel dengan 95% limfositnya hidup.
Pengujian Proliferasi Sel Limfosit Secara in vitro dengan Penghitungan Sel Hidup Menggunakan Metode MTT/ 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (Kim et al 2003)
Pengujian proliferasi sel limfosit in vitro ini bertujuan untuk melihat kemampuan proliferasi sel limfosit yang diberi ekstrak daun kumis kucing dan bunga kenop di luar tubuh atau jaringan melalui teknik kultur sel. Penelitian secara in vitro sering dilakukan untuk mempelajari perilaku sel hewan yang bebas dari keragaman sistemik yang biasanya muncul pada hewan selama homeostatis normal dan di bawah perlakuan percobaan.
Sel limfosit yang digunakan adalah sel limfosit yang diisolasi dari limfa tikus yang tidak diberi perlakuan secara in vivo (tikus kelompok kontrol). Suspensi sel limfosit ditepatkan menjadi 2 x 106 sel/ml dalam medium RPMI-1640. Selanjutnya dikultur pada microplate 96 sumur dengan volume total masing- masing sumur 100 µl dengan bahan-bahan tambahan yang ditanamkan ke dalam kultur pada Tabel 2.
Tabel 2 Bahan-bahan yang ditanam ke dalam kultur sel Perlakuan RPMI (µl) Suspensi
sel (µl) Mitogen (µl) Ekstrak (µl) FBS (µl) Blanko 90 - - - 10 Kontrol 20 70 - - 10 Perlakuan mitogen* - 70 20 - 10 Perlakuan Ekstrak** - 70 - 20 10
* Mitogen : Lipopolisakarida (LPS), Concanavalin A (Con-A)dan Pokeweed (PK).
** Ekstrak : Ekstrak daun kumis kucing dan bunga kenop dengan tujuh dosis seperti terlihat pada Tabel 3 dan Lampiran 6.
Ekstrak daun kumis kucing dan bunga kenop yang ditambahkan pada kultur terdiri dari 7 dosis pada Tabel 3.
Tabel 3 Dosis ekstrak daun kumis kucing dan bunga kenop dari konsumsi normal perhari
No. Tingkatan dosis ekstrak Kumis kucing (mg ekstrak/ml medium RPMI) Bunga kenop (mg ekstrak/ml medium RPMI) 1 C1 (dosis awal) 0.6 0.4 2 C2 (2 x C1) 1.2 0.8 3 C4 (2 x C2) 2.4 1.6 4 C8 (2 x C4) 4.8 3.2 5 C16 (2 x C8) 9.6 6.5 6 C32 (2 x C16) 19.2 13.1 7 C64 (2 x C32) 38.4 26.3
Aquarini (2006) menentukan dosis ekstrak untuk kultur sel berdasarkan perhitungan dosis ekstrak yang ada dalam darah manusia pada konsumsi normal yaitu 6 g untuk bubuk daun kumis kucing dan 9.5 g untuk bubuk bunga kenop, tanpa memperhitungkan efisiensi penyerapan dalam pencernaan (Lampiran 7).
Kultur sel diinkubasi pada suhu 37oC dengan atmosfer mengandung CO2
5%, O2 95% dan RH 96% selama 72 jam. Enam jam sebelum masa inkubasi berakhir, ke dalam masing- masing sumur ditambahkan 10 µl larutan MTT 0.5% dan diinkubasi kembali selama 4 jam.
Setelah masa inkubasi berakhir, 80 µl HCl- isopropanol 0,04 N ditambahkan pada setiap sumur. Kemudian absorbansi masing- masing sumur diukur dengan mengunakan microplatereader pada panjang gelombang 570 nm. Nilai OD hasil pembacaan menggunakan ELISA reader bersifat proporsional terhadap jumlah sel hidup. Indeks Stimulasi (IS) dihitung dengan menggunakan persamaan berikut:
kontrol OD
perlakuan OD
IS =
Pengujian Proliferasi Sel Limfosit secara in vivo–in vitro
Metode kultur sel yang digunakan pada analisis in vivo-in vitro sama dengan analisis in vitro, yang berbeda hanyalah sel limfosit yang digunakan. Sel limfosit yang digunakan dalam analisis in vivo-in vitro ini adalah sel limfosit yang diisolasi dari limfa tikus yang telah diberi perlakuan in vivo minuman ekstrak bubuk daun kumis kucing dosis 0.4 dan 0.8 g/ekor/hari dan bunga kenop dosis 0.6 dan 1.2
g/ekor/hari selama 8 minggu. Setelah itu tikus dietanasi, lalu diambil limfa dan diisolasi sel limfositnya mengikuti tahapan prosedur pada analisis in vitro.
Rancangan Percobaan
Penelitian ini menggunakan Rancangan acak lengkap (RAL) dengan tiga kali ulangan yang dilakukan pada uji total fenol dan aktivitas antioksidan sedangkan perlakuan yang diterapkan pada studi in vivo, in vitro dan in vivo-in vitro ada 2 macam yaitu jenis mitogen yang terdiri dari Con-A, PWM dan LPS serta ekstrak daun kumis kucing dan bunga kenop yang terdiri dari 7 dosis yang ditambahkan pada kultur sel.
Yij = µ + αi + εij Keterangan:
Yij = hasil pengamatan pada perlakuan ke- i faktor α pada ulangan ke-j
µ = nilai tengah populasi
αi = pengaruh perlakuan ke- i dan faktor α
εij = pengaruh kesalahan percobaan (galat baku) pada taraf ke- i, ulangan ke-j Analisis data menggunakan analisis raga m. Jika hasil analisis ragam berbeda nyata, dilanjutkan dengan uji Duncan multi range test untuk melihat perlakuan mana yang berbeda. Persamaan untuk menghitung uji lanjut Duncan multi range test yaitu: Rp = rp(a, p, dbg) − Y S r KTG = − Y S dimana:
a = Nilai tabel Duncan pada taraf nyata a p = Jarak peringkat 2 perlakuan
dbg = Nilai derajat bebas galat KTG = Nilai kuadrat tengah galat r = Banyaknya ulangan