BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.3. Pemeriksaan Mikrobiologis
4.3.3. Pengujian potensi probiotik Bakteri Asam Laktat
Daya tahan hidup dalam lingkungan seperti dalam saluran pencernaan yaitu dengan adanya garam empedu (bile salt) dan dengan pH rendah dalam suasana lambung merupakan persyaratan penting yang perlu dimiliki bakteri probiotik.
4.3.3.1 Daya tahan hidup dalam lingkungan pH rendah
Hasil uji keempat isolat mempunyai daya tahan hidup dalam MRSB dengan dengan HCl pH 2 dan 3 seperti terlihat pada Gambar 4.6.
Gambar 4.6. Pertumbuhan dan Daya Tahan Hidup Isolat Bakteri Asam Laktat dari Dengke Naniura dalam MRSB pH 2 dan 3
Uji daya tahan hidup bakteri probiotik pada pH rendah dilakukan dengan menumbuhkan isolat bakteri pada MRS broth dengan menambahkan HCl 0,1 M hingga pH 2 dan 3 dan diinkubasi selama 2 jam. Isolat D7B3 mempunyai daya tahan hidup paling tinggi yaitu 100 % pada pH 3 dan bertahan hidup pada pH 2 sebanyak 86%. Isolat D7DBF4 tumbuh sebanyak 90% pada pada pH 3, namun hanya bertahan hidup sebanyak 24% pada pH 2. Isolat D7DA3 dan D7DN3 dapat bertahan hidup masing-masing 58% dan 55% pada pH 3 dan tetap bertahan pada pH 2 dengan masih hidup masing-masing 58% dan 52%.
Sadrani et al. (2013) menguji daya tahan hidup bakteri pada pH 2.5 dengan waktu inkubasi 30, 60 dan 90 menit dan menemukan bahwa isolat Lactobacillus
0 20 40 60 80 100 120
D7DA3 D7B3 D7DBF4 D7DN3 D7DA3 D7B3 D7DBF4 D7DN3
pH2 pH3
o jam 2 jam CFU/g
plantarum OC6 dapat hidup 79% setelah 60 dan 90 menit pada pH 2.5, sementara isolat Lactobacillus paracasei bertahan hidup hanya 50%. Qamsari et al. (2016) menemukan bahwa Lactobacillus acidophillus ATCC4356 menunjukkan daya tahan hidup yang tinggi (92.4%) dalam suasana asam.
Probiotik dikategorikan baik bila mempunyai kemampuan hidup pada pH ≤ 3 (Fernandez et al., 2003). Menurut Drasar dan Barrow (1985) kondisi pH terendah pada saluran pencernaan diperkirakan pada gizzard yaitu 2,50. Lin et al. (2006) menyatakan bahwa BAL dengan daya tahan hidup lebih besar dari 50% dalam suasana pH lambung dianggap mempunyai daya tahan hidup yang tinggi.
4.3.3.2 Daya tahan hidup dalam larutan garam empedu
Hasil pengujian menunjukkan bahwa keempat isolat dapat tumbuh pada MRSB dengan garam empedu sodium deoxycholate sebagai (bile salt) konsentrasi 1, 2 dan 3% yang diinkubasi sampai 4 jam seperti terlihat pada Gambar 4.7.
Gambar 4.7. Pertumbuhan dan Daya Tahan Hidup Isolat Bakteri Asam Laktat dari Dengke Mas Naniura dalam Garam Empedu
Pada uji daya tahan hidup dalam garam empedu, D7B3 mempunyai daya tahan hidup paling tinggi dengan bertahan hidup sebanyak 78 % pada MRSB dengan konsentrasi garam empedu 1%, hidup 71% pada garam empedu konsentrasi 2%, dan masih bertahan hidup sebanyak 66% pada konsentrasi garam empedu 3%. Isolat
0 10 20 30 40 50 60 70
D7DA3 D7B3 D7BF4 D7DN3 D7DA3 D7B3 D7DBF4 D7DN3 D7DA3 D73B D7DBF4 D7DN3
Garam Empedu 1% Garam Empedu 2% Garam Empedu 3%
0 jam 4 jam CFU
/gr
bakteri D7DA3, D7DN3 dan D7BF4 dapat hidup sebanyak 63-68% pada garam empedu konsentrasi 1% dan 54-61% pada garam empedu konsentrasi 2%. Pada garam empedu konsentrasi 3%, D7DA3 dan D7DN3 bertahan hidup masing-masing 61 dan 56% sementara isolat D7BF4 mempunyai persentase hidup paling rendah yaitu 38 %. Uji daya tahan hidup Lactobacillus dalam garam empedu 1 dan 2%
selama 4 jam yang dilakukan oleh Sadrani et al. (2013) menunjukkan bahwa dua isolat mempunyai daya tahan 100%, dua isolat dapat hidup sekitar 90% dan dua isolat menunjukkan 90 dan 74% dalam garam empedu 1%, dan menurun menjadi 69 dan 58% dalam garam empedu 2%.
Garam empedu berfungsi dalam pencernaan lemak pada sistim pencernaan.
Konsentrasi garam empedu yang dikeluarkan oleh kelenjar empedu adalah sekitar 1.5-2% (w/v) pada jam pertama proses pencernaan dan selanjutnya dapat menurun sekitar 0.3% (Noriega et al., 2004). Konsentrasi garam empedu pada lumen adalah 0,5% dan waktu penyerapan makanan di usus kecil adalah 4 jam (Argyri, 2013).
Daya tahan terhadap garam empedu merupakan karakteristik penting bagi Bakteri Asam Laktat, sebab berpengaruh terhadap aktivitasnya dalam saluran pencernaan, terutama saluran usus bagian atas tempat empedu disekresikan (Gilliand,1984). Empedu bersifat sebagai senyawa aktif permukaan yang menyebabkan aktifnya enzim lipolitik yang disekresikan pankreas. Enzim ini bereaksi dengan asam lemak pada membran sitoplasma bakteri sehingga mengakibatkan perubahan struktur membran dan sifat permeabilitasnya. Keragaman struktur asam lemak pada membran sitoplasma bakteri menyebabkan perbedaan permeabilitas dan karakteristiknya sehingga mungkin mempengaruhi ketahanannya terhadap garam empedu (Susanti et al.,2007).
Dari hasil pengujian potensi probiotik isolat Bakteri Asam Laktat dari dengke naniura, keempat isolat dapat tumbuh pada MRSB pH rendah yaitu 2 dan 3 yang diinkubasi selama 2 jam demikian juga pada MRSB dengan garam empedu konsentrasi 1, 2 dan 3% dengan waktu inkubasi selama 4 jam.
Pengujian potensi probiotik telah dilakukan terhadap Lactobacillus yang diisolasi dari beberapa jenis buah dan makanan fermentasi (Sadrani et al., 2014), makanan fermentasi asal Indonesia (Rahayu et al., 2003, Rahayu et al., 2013) usus udang (Romadhon et al., 2012). Walaupun tingkat toleransi yang dibutuhkan untuk
pertumbuhan maksimum dalam saluran pencernaan tidak diketahui, namun saat ini dapat diterima bahwa spesies yang tahan terhadap garam empedu dan asam dapat menunjukkan daya tahan bakteri untuk hidup dalam usus halus dan colon dan memberi pengaruh baik dalam mempertahankan keseimbangan mikrobiota pencernaan (Sadrani et al.,2014).
4.3.3.2 Aktivitas antibakteri secara in vitro
Kemampuan menghambat bakteri patogen yang dapat hidup dalam saluran pencernaan merupakan kriteria penting bagi bakteri probiotik. Hal ini dapat dilihat dengan terbentuknya zona bening disekitar paper disk yang sebelumnya telah direndam dalam suspensi isolat seperti terlihat pada Gambar 4.8.
a b
c
Gambar 4.8. Hasil Uji Antimikrobia Isolat Bakteri Berpotensi Probiotik dari Dengke Naniura. (a: paper disk isolat bakteri dari dengke naniura; b:
zona bening antibakteri; c: media bakteri patogen)
Hasil uji menunjukkan bahwa keempat isolat mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen seperti terlihat pada Tabel 4.7. Hasil pengujian menunjukkan bahwa semua isolat mempunyai daya hambat terhadap bakteri patogen gram negatif dan gram positif seperti terlihat pada Tabel 4.7. Isolat D7DBF4 mempunyai daya hambat
paling tinggi (12,97) terhadap bakteri patogen gram positif Bacillus cereus. Isolat D73B mempunyai daya hambat paling rendah (6,00) terhadap bakteri patogen gram negatif Salmonella typhi. Dari keenam isolat yang diisolasi dari dengke naniura, D7DBF4 dan D7BN3 mempunyai daya hambat paling tinggi baik terhadap bakteri patogen gram positif maupun gram negatif, sementara isolat D7B3 mempunyai daya hambat terendah.
Tabel 4.7. Uji Aktifitas Antibakteri Isolat Bakteri Asam Laktat dari Dengke Naniura
Bakteri D7DA3 D7B3 D7DBF4 D7BN3
Bakteri Patogen Gram Negatif
Escherichia coli 9,45 ±0,45 6,30 ± 0,18 12,00± 0,50 10,43±1,60 Pseudomonas aeruginosa 7,43 ±0,06 6,10 ± 0,08 9,30 ± 0,40 9,30 ±0,75 Salmonella typhi 9,37 ±0,21 6,00 ± 0,00 9,33 ± 0,81 9,27 ±0,64 Enterococcus faecalis 8,40 ±0,10 6,08 ± 0,12 9,37± 0,47 10,25±0,25 Bakteri Patogen Gram
Positif
Staphylococus aureus 8,80 ±0,10 6,07 ± 0,09 10,40± 0,26 10,13±0,25 Bacillus cereus 7,63 ±0,15 6,17 ± 0,12 12,97± 1,31 8,43 ± 0,61 Bacillus subtilis 7,73 ±0,59 6,90 ± 0,15 12,27± 0,12 12,93±0,42
Keterangan: hasil yang disajikan adalah rata-rata tiga kali analisa dan standar deviasinya.
Diameter zona hambat terhadap bakteri uji Gram negatif (6,00-10,30 mm) lebih kecil dibanding diameter zona hambat terhadap bakteri Gram positif (6,07-12,97 mm).
Rauta et al. (2013) menggolongkan derajat zona penghambatan antibakteri atas tiga tingkatan yaitu zona penghambatan moderat (moderate inhibition zone) yaitu 6-9 mm; zona penghambatan kuat (strong inhibition zone) yaitu 10-14 mm dan zona penghambatan sangat kuat (very strong inhibition zone) yaitu 15-18 mm. Rauta et al.
(2013) mengisolasi Lactobacillus dari limbah dapur termasuk usus ikan dan dalam uji antibakteri, Lactobacillus delbrueckii mempunyai daya hambat sangat kuat terhadap bakteri patogen gram negatif Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa dan gram positif Bacillus subtilis dibandingkan Lactobacillus casei. Demikian juga Sadrani et al. (2013) menemukan daya hambat antibakteri Lactobacillus paracasei dan Lactobacillus plantarum lebih besar terhadap bakteri gram positif dibandingkan terhadap bakteri patogen gram negatif.
Pada umumnya bakteri gram negatif memiliki struktur dinding sel yang lebih kompleks, yaitu lapisan luar berupa lipopolisakarida dan lapisan dalam berupa peptidoglikan sehingga mempunyai daya tahan yang lebih baik terhadap senyawa antimikroba. Pada bakteri gram positif struktur dinding sel lebih sederhana, sehingga memudahkan senyawa antimikroba masuk ke dalam sel (Ray,1996). Mekanisme aktifitas antimikroba yang disebabkan oleh asam organik yang dihasilkan isolat BAL adalah dengan penurunan pH yang diiringi dengan bentuk tidak terdisosiasi dari molekul. Pada pH di bawah 5, molekul asam organik yang tidak terdisosiasi sangat tinggi. Dalam bentuk tidak terdisosiasi, asam organik cenderung lipofilik dan masuk melalui membran sel. pH dalam sel menjadi lebih rendah yang menyebabkan disosiasi molekul asam sehingga proton (H+) dan anion terlepas. Banyaknya asam yang tidak terdisosiasi dapat mengubah permeabilitas membran sel yang menyebabkan hancurnya sistem transpor bahan pada bakteri tersebut. Hal ini dapat menyebabkan kematian (lisis) sel. Perusakan dinding sel pada bakteri menyebabkan terganggunya sintesis komponen penyusun dinding sel, hal ini menyebabkan dinding sel sangat lemah dan mengalami lisis (Ray,1996). Asam organik khususnya asam laktat bersifat bakterisidal pada pH 4,5 dengan konsentrasi di atas 0.2% (Ray dan Daeschel, 1992). Surono (2004) menjelaskan bahwa beberapa jenis Bakteri Asam Laktat menghasilkan bakteriosin, suatu peptida yang bersifat antibakteri, toksin yang berupa protein yang dapat mencegah pertumbuhan bakteri.
4.4 Aplikasi Bakteri Potensi Probiotik dalam Susu Fermentasi