METODE Lokasi dan Waktu
B. Pengujian Ransum secara in vitro
Pengujian ransum secara in vitro meliputi pengukuran terhadap produksi gas, konsentrasi VFA total, konsentrasi NH3, produksi biomassa mikroba, degradabilitas bahan kering dan bahan organik (DBK dan DBO).
1. Pengukuran Produksi Gas
Metode pengukuran produksi gas yang digunakan adalah Hohenheim Gas Test (Menke et al., 1979; Menke dan Steingass, 1988). Prosedur ini dimulai dengan penimbangan sampel sebanyak 0,375 gram. Sebelumnya, sampel dikeringkan pada suhu 600C dan dihaluskan dengan saringan berukuran 1 mesh. Setelah ditimbang, sampel dimasukkan ke dalam syringe Hohenheim dengan kapasitas 100 ml. Larutan dan media dipersiapkan terlebih dahulu.
Adapun larutan-larutan yang digunakan adalah sebagai berikut: a. Larutan Mikromineral
Larutan mikromineral ini merupakan campuran bahan-bahan kerjanya 13, 2 gram CaCl2.2 H2O, 10 gram MnCl2.4 H2O, 1 gram CoCl2.6 H2O, 8 gram FeCl3.6 H2O, dan aquadest sehingga menjadi 100 ml larutan.
b. Larutan Buffer Rumen
Larutan buffer rumen ini merupakan campuran bahan-bahan yang terdiri atas 4 gram NH4HCO3, 35 gram NaHCO3, dan aquadest sehingga menjadi 1000 ml larutan.
c. Larutan Makromineral
Larutan makromineral ini merupakan campuran bahan-bahan berikut 5,7 gram Na2HPO4 anhydrous, 6,2 gram KH2PO4 anhydrous, 0,6 gram MgSO4. 7 H2O, dan aquadest hingga menjadi 1000 ml larutan.
d. Larutan Resazurin 0,1 % (b/v)
Larutan resazurin ini dibuat dengan melarutkan 0,1 g resazurin dan aquadest hingga menjadi 100 ml larutan.
e. Larutan Pereduksi
Larutan pereduksi ini merupakan campuran antara bahan-bahan berikut 3,7 ml NaOH 1 N, 580 mg Na2S.9H2O dan 60 ml aquadest.
Persiapan media dilakukan dengan mencampurkan 752,26 ml air destilasi, 0,16 ml larutan mikromineral (a), 501,5 ml larutan buffer rumen (b), 250,76 ml larutan makromineral (c) dan 0,68 ml larutan resazurin (d). Media dipersiapkan sehari sebelum pengambilan cairan rumen, dibiarkan di dalam labu Erlenmeyer besar dan ditutup rapat dengan kertas film agar tetap dalam kondisi anaerob (dialiri gas CO2 selama 5 menit). Campuran media dan 453,42 ml cairan rumen (suhu 39°C) tersebut diaduk dengan magnetic stirrer bersamaan dengan dialirinya gas CO2 selama 5 menit, lalu ditambah larutan pereduksi sebanyak 41,22 ml (e).
Medium telah mengalami perubahan warna dari biru menjadi merah muda dan akhirnya tidak berwarna. Hal ini menunjukkan bahwa proses reduksi terjadi secara sempurna. Sebanyak 30 ml cairan rumen dan campuran media diinjeksikan ke dalam setiap syringe Hohenheim yang telah berisi 0,375 gram sampel didalamnya melalui selang silikon dengan dispenser yang telah diatur volumenya. Sebelum dimasukkan ke dalam syringe, piston terlebih dahulu dilumuri dengan vaselin. Hal ini dilakukan agar gas tidak bocor keluar. Gelembung gas yang terdapat di dalam syringe dikeluarkan, lalu selang silikon ditutup dengan klem, posisi piston dibaca dan dicatat pada jam ke nol (0). Proses inkubasi kemudian dilakukan dan produksi gas yang dihasilkan diamati pada selang waktu inkubasi 0, 3, 6, 9, 12, 24 dan 48 jam pada suhu 39oC dalam water bath incubator. Sampel yang diinkubasi masing-masing duplo. Jika posisi piston di atas 60 ml, nilai ini dicatat lalu klem dibuka dan piston dikembalikan pada posisi 30 ml, kemudian jumlah gas sebelumnya dicatat. Pembacaan dilakukan dengan cepat agar tidak terjadi perubahan suhu. Produksi gas dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
(V48 – V0 – Gb0) x 200 PG (ml/200 mg BK 48 jam) =
B Keterangan :
PG = produksi gas
Gb0 = produksi gas rata-rata blanko pada inkubasi 48 jam B = berat sampel uji dalam mg BK
2. Pengukuran Konsentrasi VFA Total
Analisis VFA dilakukan dengan teknik Destilasi Uap (Steam Destilation). Supernatan yang telah terpisah dari residu yang terdapat dalam tabung sentrifus diambil sebanyak 5 ml, lalu dimasukkan ke dalam tabung yang telah berisi 1 ml H2SO4 15% sebagai pengawet. Sebanyak 2 ml larutan tersebut diambil dan kemudian dimasukkan ke dalam tabung destilasi.
Tabung destilasi dimasukkan ke dalam labu penyulingan yang berisi air mendidih (dipanaskan terus selama destilasi). Uap air panas akan mendesak VFA dan akan terkondensasi dalam pendingin. Destilat yang terbentuk ditampung sampai mencapai volume 100 ml di dalam labu Erlenmeyer. Indikator phenolphthalein ditambahkan sebanyak 2 – 3 tetes, kemudian dititrasi dengan NaOH 0,1 N sampai warna titrat berubah menjadi merah jambu. Produksi VFA total dapat dihitung dengan rumus :
(a+b) 100 c a VFA total (mmol/100 ml) = ml titran x N NaOH x x Keterangan : a = volume supernatan sample (5 ml) dalam tabung
b = volume H2SO4 15% (1 ml) dalam tabung
c = volume larutan sample (a+b) yang dalam tabung destilasi (2 ml) N = Normalitas NaOH (0,1 N)
ml titran x N NaOH x 100 x 10 x Fp
VFA Total (mM) = ml sample
Keterangan : N = Normalitas NaOH (0,1 N) Fp = Faktor Pengenceran (6/5) 3. Pengukuran Konsentrasi NH3
Analisis NH3 dilakukan dengan metode Mikrodifusi Conway. Supernatan yang telah terpisah dari residu yang terdapat dalam tabung sentrifus diambil sebanyak 5 ml, lalu dimasukkan ke dalam tabung yang telah berisi 5 ml NaCl 20% sebagai pengawet. Sebanyak 1 ml larutan tersebut diambil dan ditempatkan pada salah satu ujung alur cawan Conway yang bibir dan tutupnya terlebih dahulu diolesi dengan vaselin. Larutan K2CO3 sebanyak 1 ml ditempatkan pada salah satu ujung
alur cawan lain yang bersebelahan dengan supernatan (kedua bahan tersebut tidak boleh bercampur sebelum cawan ditutup rapat). Larutan asam borat berindikator merah metil dan hijau bromo kresol sebanyak 1 ml pada pH 5,5 dipipet dan dimasukkan ke dalam cawan kecil yang terletak di tengah cawan Conway. Cawan Conway yang bibir dan tutupnya sudah diolesi vaselin ditutup rapat hingga kedap udara, larutan K2CO3 dicampurkan dengan supernatan hingga merata dengan cara menggoyang-goyangkannya dan memiringkannya. Cawan Conway lalu dibiarkan selama 2-3 jam pada suhu kamar. Setelah 2-3 jam, tutup cawan dibuka, asam borat dititrasi dengan HCl 0,01037 N, sampai warnanya berubah dari biru menjadi kemerah – merahan. Konsentrasi NH3 diukur dengan rumus :
(a+b) 100 c a Konsentrasi NH3 (mg%) = ml titran x N HCl x BM NH3 x x
Keterangan : a = volume supernatan sample (5 ml) dalam tabung b = volume NaCl 20% (5 ml) dalam tabung
c = volume larutan sample (a+b) di dalam cawan Conway (1 ml) N = Normalitas HCl (0,01037 N) BM = Bobot Molekul NH3 (17,0304) ml titran x N HCl x BM NH3 x 100 x 10 x Fp Konsentrasi NH3 (mM) = ml sample x 14 Keterangan : N = Normalitas HCl (0,01037 N) BM = Bobot Molekul NH3 (17,0304) Fp = Faktor Pengenceran (10/5) 4. Pengukuran Produksi Biomassa Mikroba
Sampel residu produksi gas setelah inkubasi selama 48 jam dipindahkan ke dalam tabung sentrifus, kemudian disentrifus dengan kecepatan 12.500 rpm selama 20 menit. Residu kemudian dimasukkan ke dalam oven 105oC selama 4-5 jam dan yang ditimbang adalah residu kecernaan semu (apparent degraded substrate).
Sampel residu produksi gas setelah inkubasi selama 48 jam dimasukkan ke dalam beaker glass lalu ditambahkan larutan Neutral Detergent Solution (NDS). Residu ini selanjutnya dipanaskan sampai mendidih dan dilanjutkan refluks selama 1 jam sampai warna coklat tua. Hasil refluks disaring dengan gelas crucible, kemudian residu yang diperoleh dimasukkan ke dalam oven 105oC selama 4-5 jam dan yang
ditimbang adalah residu kecernaan sebenarnya (truly degraded substrate). Biomassa mikroba yaitu substrat terdegradasi semu (apparent degraded substrate) dikurangi dengan substrat terdegradasi sebenarnya (truly degraded substrate) (Blummel et al., 1997).
Biomassa mikroba = B – A Keterangan :
A = Substrat terdegradasi sebenarnya (truly degraded substrate) B = Substrat terdegradasi semu (apparent degraded substrate)
5. Pengukuran Degradabilitas Bahan Kering dan Bahan Organik
Setelah fermentasi 48 jam, fermentasi mikroba rumen dihentikan. Syringe Hohenheim diletakkan di atas air dingin atau es untuk menghentikan aktifitas mikroba, lalu secara bergantian isi syringe dimasukkan ke dalam beaker glass dan ditambah larutan Neutral Detergent Solution (NDS). Beaker glass selanjutnya dipanaskan sampai mendidih dan dilanjutkan refluks selama 1 jam sampai warna coklat tua. Hasil refluks disaring dengan gelas crucible dan dimasukkan ke dalam oven 105oC selama 24 jam. Residu kecernaan sebenarnya ditimbang dan dimasukkan ke oven 105oC untuk mendapatkan residu bahan kering (BK). Selanjutnya residu bahan kering dimasukkan ke tanur 550-600oC untuk mendapatkan abu, dan bahan yang hilang selama di tanur adalah residu bahan organik (BO residu). Hal yang sama juga dilakukan pada blanko. Blanko merupakan residu asal fermentasi tanpa contoh bahan makanan (sampel). Bahan asal adalah media dan cairan rumen yang mendapat perlakuan sama lalu difermentasi untuk diambil residunya (Blummel et al., 1997). Degradabilitas bahan kering (DBK) dan degradabilitas bahan organik (DBO) dihitung dengan rumus :
BK Sampel (g) – BK Residu Akhir (g) – BK Blanko (g) BK sampel (g)
DBK (%) = x 100%
BO Sampel (g) – BO Residu Akhir (g) – BO Blanko (g)
DBO (%) = x 100%
BO sampel (g) Keterangan :
BK = Bahan kering BO = Bahan organik
HASIL DAN PEMBAHASAN