HASIL DAN PEMBAHASAN
4.2 Pengukuran Zona Bening Isolat Jamur
Aktivitas proteolitik isolat jamur diukur secara kuantitatif (Tabel 4.2) dan kualitatif (Gambar 4.3) berdasarkan zona bening yang dihasilkan pada media SMA.
Pengukuran secara kuantitatif diamater zona bening semua isolat terpilih menunjukkan hasil yang berbeda-beda. Adanya perbedaan diameter zona bening mengindikasikan potensi dari semua isolat jamur dalam menghasilkan protease khususnya keratinase juga berbeda-beda. Zona bening masing-masing jamur diukur pada hari ke-3 dan hari ke-6. Keseluruhan data hasil pengukuran zona bening jamur disajikan pada Tabel 4.2
A C
D E F
B
E F
17
Tabel 4.2 Zona Bening Isolat Jamur Keratinolitik dari Tanah Peternakan Ayam dan Kambing
Isolat K13 memiliki diameter aktivitas proteolitik paling tinggi dari semua isolat jamur yang diujikan pada media SMA. Diameter zona bening yang mampu dihasilkan pada hari ke-3 sebesar 71 mm dan pada hari ke-6 sebesar 90 mm. Isolat lainnya yang memiliki diameter zona bening yang tinggi yaitu isolat A9. Pengamatan hari ke-3, isolat A9 menghasilkan zona bening sebesar 46,5 mm dan pada hari ke-6 sebesar 81,65 mm. Kemampuan isolat jamur dengan diameter paling rendah yaitu isolat A5 menghasilkan zona bening yang paling rendah sebesar 9,9 mm pada hari ke-3 sedangkan pada hari ke-6 sebesar 25,3 mm.
Adanya peningkatan diameter zona bening isolat jamur setelah masa inkubasi hari ke-3 dan hari ke-6 disebabkan karena masing-masing isolat menghasilkan protease yang berbeda-beda untuk menguraikan media SMA. Penguraian subtrat oleh jamur akan menyebabkan pertumbuhan diameter koloni jamur yang disertai dengan zona bening. Pengamatan diameter isolat jamur hanya dilakukan selama masa
18
inkubasi 6 hari karena ada beberapa isolat jamur yang sudah memenuhi keseluruhan diameter cawan petri. Berikut beberapa aktivitas proteolitik isolat jamur dengan zona bening yang dihasilkan secara kualitatif pada media SMA yang dapat dilihat pada Gambar 4.3.
Gambar 4.3 Diameter Zona Bening Isolat jamur (a) K2 (Hari ke 3); (b) A18 (Hari ke 3); (c) A13 (Hari ke 3); (d) K2 (Hari ke 6); (e) A18 (Hari ke 6); (f) A13 (Hari ke 6)
Berdasarkan Gambar 4.3 dapat dilihat diameter zona bening secara kualitataif dari beberapa isolat jamur yang diujikan pada media SMA. Terurainya media SMA diketahui setelah terbentuk zona bening di sekitar koloni jamur yang diikubasi selama 6 hari. Pengamatan diameter zona bening hari ke-3 dan hari ke-6 dilakukan untuk mengetahui perbedaan diameter zona bening dari masing-masing isolat jamur.
Data yang diperoleh dari 46 isolat jamur pada pengamatan hari ke-6 sekitar 15,21%
jamur menghasilkan zona bening dengan diameter 20 mm sampai 30 mm, 30,43%
jamur dengan diameter 31 mm sampai 40 mm, 30,43% jamur dengan diameter 41 mm sampai 50 mm, 6,52% jamur dengan diameter 51 mm sampai 60 mm, 2,17%
jamur dengan diameter 60 mm sampai 70 mm, 4,43% jamur dengan diameter 71 mm sampai 80 mm, 10,86% jamur dengan diameter 81 mm sampai 90 mm.
a b c
f a
d e
b
19
Awasthi and Kushwaha (2011) melakukan uji skrining jamur pada media SMA yang diisolasi dari tanah di Kampur, India untuk mengetahui aktivitas keratinolitik secara kuantitatif dari masing-masing isolat jamur. Sebanyak 101 isolat jamur berhasil diujikan dan telah terbukti menghasilkan zona bening dengan masa inkubasi selama 8 hari. Data yang diperoleh sekitar 23,76% jamur menghasilkan zona bening dengan diameter 21 sampai 28 mm, 58,41% dengan diameter 11 sampai 20 mm, 17,82% dengan diameter 2 sampai 10 mm. Berikut merupakan beberapa jamur yang telah berhasil diujikan seperti Acremonium brunnescen MTCC 10376, Chrysosporium indicum MTCC 10377, Alternaria alternata NFCCI 1878, Cladosporium chlorocephalum GPCK 3069, Fusarium culmorum GPCK 3204 dan lain-lain.
Kumar and Kushwaha (2014) berhasil menguji 73 spesies jamur pada media SMA dengan masa inkubasi 3 hari, 6 hari, 9 hari dan 12 hari. Sebanyak 52% jamur yang diujikan tumbuh dan menghasilkan zona bening pada media SMA. Beberapa jamur yang telah diujikan dan diameter zona bening yang dihasilkan seperti Chrysosporium indicum sebesar 7 mm, Microsporum gypseum sebesar 7 mm, Acremonium strictum sebesar 8 mm dan lain-lain. Kumar et al., (2017) melaporkan dalam penelitiannya telah mengisolasi 5 jamur dengan metode umpan rambut (hair baiting method). Keseluruhan isolat telah diujikan pada media SMA dan menghasilkan diameter zona bening yang bervariasi yaitu C. tropicum sebesar 7 mm, Malbranchea sp sebesar 2 mm, Aphanoascus fulvescens sebesar 1 mm, C.
keratinophilum sebesar 1 mm dan Fusarium oxysporum tidak menghasilkan zona bening.
4.3 Pengukuran Potensi Jamur Keratinolitik
Pengujian secara kualitatif dan kuantitatif 46 isolat jamur telah dilakukan pada media SMA. Keseluruhan isolat akan diujikan pada tahapan uji degradasi limbah bulu ayam menggunakan media FMB (Gambar 4.4). Tahapan uji degradasi limbah bulu ayam menggunakan semua isolat. Menurut Suhartono (1992) aktivitas proteolitik yang ditandai dengan terbentuknya zona bening pada media padat tidak akan selalu berkorelasi dengan tingginya kemampuan menghasilkan protease pada media cair secara kuantitatif.
20
Gambar 4.4 Hasil Uji Biodegradasi Limbah Bulu Ayam Setelah Masa Inkubasi 10 Hari (a) Kontrol dan (b) Perlakuan dengan Isolat A29; (c) Perlakuan dengan Isolat K18; (d) Perlakuan dengan A18 (e) Perlakuan dengan Isolat A12; (f) Perlakuan dengan Isolat K2
Uji kemampuan degradasi limbah bulu ayam menggunakan isolat jamur dilakukan pada media FMB (Gambar 4.4) selama masa inkubasi 10 hari. Perlakuan kontrol tidak mengalami perubahan secara fisik dikarenakan kondisi bulu ayam yang terlihat masih utuh. Perlakuan isolat jamur terhadap bulu ayam menyebabkan adanya kolonisasi miselium jamur pada bulu ayam tersebut. Terurainya bulu ayam menjadi molekul yang lebih sederhana berupa asam-asam amino diasumsikan adanya enzim khusus yang disekresikan oleh jamur berupa keratinse ke media FMB sehingga dapat mendegradasi limbah bulu ayam. Hasil uji degradasi dari keseluruhan isolat jamur menunjukkan kemampuan yang bervariasi antar isolat yang berbeda (Tabel 4.3).
Isolat jamur yang pada media FMB dishaker/digoncang yang bertujuan supaya isolat jamur lebih mudah mengkolonisasi subtrat (bulu ayam) sehingga proses degradasi berlangsung dengan cepat. Menurut Bockle dan Muller (1997); Onifade et al., (1998) menyatakan bahwa melekatnya sel/kolonisasi pada substrat merupakan hal yang penting dalam proses degradasi bulu ayam.
a
d e
b c
d f
21
Tabel 4.3 Berat Akhir Bulu Ayam setelah Masa Inkubasi 10 hari
Kode Isolat
Rerata Rerata Rerata Rerata
Kontrol 0,4759 4,82 A30 0,0231 95,38
Keseluruhan isolat jamur yang diujikan mempunyai kemampuan dalam mendegradasi limbah bulu ayam. Hal ini dapat dilihat dari data persentase perubahan berat bulu ayam bila dibandingkan dengan perlakuan kontrol. Delapan isolat jamur dengan kode isolat A2, A7, A12, A18, A29, A31, K1, dan K2 memiliki kemampuan dalam mendegradasi bulu ayam dengan perubahan berat bulu ayam 100%.
Penelitian yang dilakukan oleh Calin et al., (2017), mengujikan beberapa jamur seperti Trichophyton sp., Fusarium sp. strain 1A, Trichoderma sp., Cladosporium sp., Microsporum sp., Fusarium sp., Phytophthora sp., dan Chrysosporium sp. untuk mengetahui potensi jamur tersebut dalam mendegradasi rambut kuda. Uji degradasi dilakukan selama masa inkubasi 21 hari dengan kondisi digoncang. Pemisahan miselium jamur dengan rambut kuda dilakukan dengan cara dicuci sehingga didapatkan sisa hasil uji degradasi dan selanjutnya dikeringkan pada
22
suhu 60 0C selama 48 jam. Perlakuan Fusarium sp. strain 1A mampu mendegradasi rambut kuda dengan perubahan berat akhir 71,10%.
Uji degradasi limbah bulu ayam menggunakan bakteri telah berhasil dilakukan. Bungsu (2018), berhasil mengujikan 2 bakteri keratinolitik terhadap limbah bulu ayam dengan hasil persentase penurunan berat bulu ayam 43% dan 37%
setelah masa inkubasi 10 hari pada kondisi digoncang pada kecepatan 120 rpm.
Larasati (2015), berhasil mengujikan 2 bakteri keratinolitik yang mampu mendegradasi limbah bulu ayam mencapai 62,5% dan 56,9%. Pengujian bakteri keratinolitik dalam mendegradsi limbah bulu ayam dilakukan selama masa inkubasi 25 hari pada suhu 30 0C
Biodegradasi limbah bulu ayam dengan menggunakan jamur seperti Aspergillus niger (Setyabudi, 2015); A. sctritum, C. indicum, C. tropicum (Kumar dan Kuswaha, 2014) yang memiliki aktivitas keratinolitik merupakan metode alternatif yang dapat digunakan untuk meningkatkan nilai limbah keratin dari bulu ayam. Struktur protein keratin dapat didegradasi oleh keratinase yang dihasilkan oleh mikroorganisme. (Panuju, 2003).
Keratinase mempunyai kemampuan sangat baik dalam menurunkan kadar keratin melalui perombakan sturktur jaringan kimia dinding sel, pemotongan ikatan hidrogen dan ikatan disulfida penyusun keratin (Rodriguez et al., 2009). Banyaknya ikatan disulfida pada struktrur keratin akan menstimulasi sel untuk mensekresikan enzim disulfida reduktase sebagai proses awal membukanya struktur keratin.
Terbukanya struktur keratin menyebabkan keratinase lebih mudah mengakses peptida target pada molekul keratin dan menyempurnakan proses degradasi sehingga nutrisi keratin dapat dimanfaatkan oleh sel (Rahayu, 2010).
Degradasi limbah bulu ayam pada media FMB menghasilkan asam-asam amino yang terdapat pada sisa media cair (filtrat). Penambahan TCA 0,1 M pada media cair berfungsi untuk mengendapkan protein sehingga hanya ada asam amino yang larut dalam sisa media. Menurut Novo (1981), laju pembentukan peptida dan asam amino tersebut dapat dijadikan aktivitas katalisis protease. Penambahan TCA berguna untuk memisahkan produk yang mengandung peptida dan asam amino, sedangkan protein yang tidak terhidrolisis akan mengendap. Penambahan TCA
23
sekaligus menginaktivasi protease. Proses pengendapan protein lebih mudah jika dilakukan dengan pengerjaan menggunakan sentrifugasi.
Tabel 4.4 Jumlah Asam Amino yang Dilepaskan
Kode
Total Asam Amino Total Asam Amino
Rerata Rerata Rerata Rerata
Kontrol 1,531 233,373 A29 1,577 240,562
Hasil pengukuran nilai serapan absorbansi media cair (filtrat) dari masing-masing isolat jamur dapat dilihat pada Tabel 4.4. Asam amino yang terdeteksi pada panjang gelombang 280 nm mengindikasikan terjadinya degradasi limbah bulu ayam oleh isolat jamur. Hasil nilai serapan absorbansi dapat disimpulkan secara umum bahwa semakin tinggi potensi jamur keratinolitik dalam mendegradasi limbah bulu ayam semakin tinggi pula nilai absorbansi yang dihasilkan. Terurainya asam-asam amino hasil uji degradasi limbah bulu ayam mengakibatkan tingginya nilai absorbansi dari masing-masing isolat jamur tersebut. Perlakuan kontrol terdeteksi kandungan asam amino, hal tersebut karena adanya penambahan yeast extract pada media FMB. Menurut Milic et al., (2007) menyatakan bahwa yeast extract mengandung komponen dari sel yeast yang larut dalam air yaitu asam amino, peptida, karbohidrat, dan garam.
24
Metode spektrofotometri UV-Vis telah banyak digunakan untuk penetapan senyawa-senyawa organik yang umumnya dipergunakan untuk penentuan senyawa dalam jumlah yang sangat kecil. Asam amino penyusun keratin diantaranya adalah triptofan, tirosin dan fenilalanin yang mempunyai gugus aromatik. Panjang gelombang 280 nm merupakan panjang gelombang yang memiliki afinitas kuat terhadap asam amino yang memiliki cincin aromatik seperti triptofan, tirosin dan fenilalanin. Asam amino tersebut merupakan asam amino yang dihasilkan dari pemecahan protein keratin (Tiwary dan Gupta, 2012). Penggunaan spektrofotometer untuk mendeteksi keberadaan asam amino dengan panjang gelombang 280 nm telah dilakukan oleh Larasati (2015). Isolat bakteri keratinolitik FU7 menunjukkan nilai serapan absorbansi pada media cair mencapai 0,937, sedangkan dengan FU10 menunjukkan serapan absorbansi sebesar 0,954.
4.4 Karakterisasi Secara Morfologi dan Identifikasi Molekuler Isolat Jamur