BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
C. Percobaan Pendahuluan
Reaksi antara glukosa dan reagen GOD-PAP merupakan reaksi enzimatis yang menghasilkan senyawa berwarna, oleh karena itu perlu dilakukan uji stabilitas
40 H O H H OH CH2OH H OH OH H OH OH H H C OH H OH CH2OH H O OH OH + O2 + H2O2 glukosa GOD
asam glukonat hidrogen
peroksida H2O2 H2N N N CH3 O CH3 PAP OH O N N CH3 N O CH3 + + + H2O fenol hidrogen peroksida 4 amino-antipirin kuinonimin
(berwarna merah muda) glukosa untuk mengetahui operating time (OT) dari reaksi tersebut. Tujuan dari penentuan operating time adalah untuk mengetahui waktu resapan saat senyawa berwarna yang terbentuk memberikan resapan yang stabil pada pengukuran menggunakan spektrofotometri visible. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 500 nm (sesuai pada leaflet enzim GOD-PAP) selama 60 menit.
Reagen GOD-PAP bekerja secara enzimatik dengan prinsip adanya GOD (glucose oxidase) akan mengkatalisis oksidasi glukosa menjadi asam glukonat dan hidrogen peroksida. Hidrogen peroksida akan bereaksi, dengan adanya enzim peroksidase, bersama dengan fenol dan 4-amino-antipirin membentuk senyawa kuinonimin yang berwarna merah muda (Gambar 6). Intensitas warna merah muda yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi glukosa.
Gambar 6. Reaksi enzimatik antara glukosa dan reagen GOD-PAP (DiaSys, 2007)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Data penetapan waktu resapan stabil larutan glukosa standar 100 mg/dl dapat dilihat pada tabel IV.
Tabel IV. Data hasil penetapan waktu resapan stabil larutan glukosa standar
Grafik hubungan resapan glukosa murni dengan waktu inkubasi seperti berikut:
Gambar 7. Grafik hubungan antara resapan dan waktu resapan stabil reaksi glukosa standar pada λ 502 nm
Dari gambar grafik di atas dapat dilihat bahwa pada menit ke-15 sampai menit ke-30 memberikan grafik yang relatif datar, ini berarti pada menit tersebut terjadi
Waktu (menit) Resapan
35 0,363 40 0,362 45 0,361 50 0,361 55 0,361 60 0,360 Waktu (menit) Resapan
5 0,336 10 0,361 15 0,365 20 0,365 25 0,364 30 0,364
42
reaksi yang stabil dan sempurna antara glukosa murni dengan pereaksi GOD-PAP. Sehingga penetapan kadar glukosa darah dapat dilakukan pada menit ke-15 sampai dengan menit ke-30 setelah pemberian pereaksi GOD-PAP.
2. Penetapan panjang gelombang maksimum
Instrumen ukur (spektrofotometer visibel) serta kondisi yang digunakan dalam penelitian ini berbeda dengan instrumen yang digunakan oleh DiaSys. Oleh karena itu perlu dilakukan pengujian untuk mengetahui besar panjang gelombang yang memberi resapan yang maksimum.
Gambar 8. Kurva hubungan antara λ dan resapan maksimum glukosa selama operating time
Penetapan panjang gelombang maksimum diukur pada rentang panjang gelombang 400 - 600 nm. Berdasarkan gambar di atas dapat kita lihat bahwa resapan maksimum terjadi pada panjang gelombang 502 nm, sedangkan pada leaflet DiaSys
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
tertera bahwa panjang gelombang saat resapan maksimum terjadi pada panjang gelombang 500 nm. Perbedaan panjang gelombang ini dikarenakan instrumentasi yang digunakan belum tentu sama, oleh karena itu pada pengukuran kadar glukosa pada percobaan ini dilakukan pada panjang gelombang 502 nm.
3. Pembuatan kurva baku
Percobaan ini menggunakan larutan glukosa monohidrat 10 mg/ml sebagai larutan stok glukosa. Pelarut yang digunakan adalah larutan asam benzoat dengan tujuan untuk mengawetkan glukosa selama kurun waktu tertentu. Pengawetan ini disebabkan karena glukosa merupakan komponen penyusun mikroorganisme dan media yang baik untuk pertumbuhan mikroorganisme sehingga penggunaan asam benzoat ini diharapkan dapat meminimalkan faktor-faktor yang dapat mengganggu penetapan kadar glukosa darah.
Pada penelitian ini penetapan kadar glukosa darah dilakukan secara spektrofotometri sehingga harus memenuhi persyaratan hukum Lambert-Beer.
Hukum Lambert-Beer menjelaskan bahwa resapan akan meningkat seiring dengan meningkatnya kadar. Oleh karena itu perlu dilakukan pembuatan kurva baku untuk menunjukkan bahwa penetapan kadar glukosa dan secara spektrofotometri ini telah memenuhi hukum Lambert-Beer.
Kurva baku dibuat dengan kadar 75 mg/dl, 100 mg/dl, 150 mg/dl, 200 mg/dl, dan 225 mg/dl. Kadar glukosa ditetapkan pada panjang gelombang 502 nm dan waktu
44
resapan maksimum pada menit ke 15 - 30 menit sesuai dengan percobaan pendahuluan yang telah dilakukan di atas.
Dari hasil pengukuran resapan larutan glukosa standar pada panjang gelombang 502 nm diperoleh data sebagai berikut:
Tabel V. Hubungan kadar dan resapan glukosa pada λ 502 nm Kadar (mg/dl) Resapan Persamaan Regresi Linear
75,37 100,49 150,74 200,99 226,11 0,266 0,343 0,478 0,668 0,717 A = 0,03217 B = 0,00306 r = 0,9976 y = 0,00306 x + 0,03217
Dari tabel V di atas terlihat bahwa harga koefisien regresi hubungan kadar dan resapan glukosa pada λ 502 nm mendekati ±1, dan setelah dibandingkan dengan r tabel dengan taraf kepercayaan 95% dengan df3 (df: degree of freedom, yaitu jumlah sampel dikurangi dua) didapat bahwa r tabel sebesar 0,878. Dapat dilihat bahwa harga r hitung lebih besar dari r tabel, sehingga dapat disimpulkan persamaan kurva baku tersebut memiliki linieritas yang baik.
Pada persamaan kurva baku tersebut sudut yang dibentuk oleh kurva hubungan konsentrasi dan serapan sangat kecil, sehingga dari segi sensitivitas, kurva tersebut tidak dapat disajikan. Oleh karena itu diperlukan faktor koreksi (manipulasi) menjadi 300 kali lebih besar, sehingga persamaan kurva baku yang diperoleh menjadi y = 0,918 x + 9,651dengan r = 0,9976.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Gambar 9. Kurva baku glukosa pada λ maksimum 502 nm selama operating time 4. Penetapan waktu pemberian suspensi glibenklamida
Waktu pemberian suspensi glibenklamida (dosis 0,45 mg/kgBB) didasarkan pada prosentase penurunan harga luas daerah di daerah kurva dari menit ke-0 sampai menit ke-300 (LDDK0-300). Hasil UTGO dan perhitungan prosentase selisih LDDK 0-300
46
Tabel VI. Hasil UTGO dan perhitungan prosentase selisih LDDK0-300 suspensi glibenklamida Waktu pemberian suspensi glibenklamida sebelum UTGO (menit ke-) LDDK0-300 (mg.menit /dl) Selisih LDDK 0-300 (mg menit /dl) % Selisih LDDK0-300 Kontrol negatif (CMC-Na) Perlakuan (suspensi glibenklamida) 15 40435,52 25659,99 14775,53 36,54 30 46982,48 19380,68 27601,80 58,75 45 45915,03 31039,28 14875,75 32,40
Dari tabel VI dapat kita lihat bahwa suspensi glibenklamida yang diberikan secara per-oral pada menit ke-30 sebelum UTGO dapat menurunkan harga LDDK0-300 sebesar 58,75% yang nilainya paling besar dibandingkan pemberian pada menit yang lain sehingga ditetapkan pemberian suspensi glibenklamida yang digunakan yaitu 30 menit sebelum UTGO. Untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada gambar 10.
Gambar 10. Diagram pengaruh waktu pemberian glibenklamida terhadap % selisih LDDK
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Dari gambar 10 dapat kita amati bahwa pada menit ke-30 glibenklamida memberikan prosentase selisih LDDK0-300 yang paling besar terhadap kontrol dibandingkan dengan menit-menit lainnya. Pada menit ke-30 ini glibenklamida menunjukkan kemampuan untuk menurunkan kadar glukosa dalam darah paling tinggi dibandingkan dengan yang lainnya. Jadi, kemampuan glibenklamida yang paling efektif dalam menurunkan kadar glukosa darah adalah pada menit ke-30, sehingga digunakan menit ke-30 sebagai waktu pemberian glibenklamida.
5. Penetapan waktu pemberian infusa biji pinang
Waktu pemberian infusa biji pinang didasarkan pada prosentase penurunan harga luas daerah di daerah kurva dari menit ke-0 sampai menit ke-300 (LDDK0-300). Dosis yang digunakan sesuai dengan penggunaan dalam masyarakat yaitu sebesar 0,765 g/kgBB. Hasil UTGO dan perhitungan prosentase selisih LDDK0-300 teringkas pada tabel berikut:
Tabel VII. Hasil UTGO dan perhitungan prosentase selisih LDDK0-300infusa biji pinang Waktu pemberian infusa biji pinang
sebelum UTGO (menit ke-) LDDK 0-300
(mg.menit/dl)
15 33059.400
30 31982.133
45 36255.125
Dari tabel VII dapat kita lihat bahwa infusa biji pinang yang diberikan secara per-oral pada menit ke-30 sebelum UTGO memberikan harga LDDK0-300 yang nilainya paling kecil, yaitu sebesar 31982.133 mg.menit/dl, sehingga ditetapkan
48
pemberian infusa biji pinang adalah 30 menit sebelum UTGO. Untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada gambar 11.
Gambar 11. Diagram pengaruh waktu pemberian infusa biji pinang terhadap LDDK
Dari gambar 11 dapat diamati bahwa pada menit ke-30 infusa biji pinang menunjukkan kemampuan untuk menurunkan kadar glukosa dalam darah paling tinggi dibandingkan dengan yang lainnya. Jadi, kemampuan infusa biji pinang yang paling efektif dalam menurunkan kadar glukosa darah adalah pada menit ke-30.
