BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
B. Persiapan dan ekstraksi sampel
Daun sirih merah sebanyak 5 kg dicuci, kemudian diangin-anginkan sampai layu kurang lebih satu hari dan dioven pada 40o C. Proses pengeringan ini bertujuan untuk mengurangi kadar air hingga kadar air dalam simplisia menjadi ≤ 10%, sehingga dapat meminimalkan pertumbuhan jamur selama proses penyimpanan simplisia.
Daun sirih merah kering diserbuk kasar sebelum dilakukan ekstraksi. Hal ini bertujuan untuk memperluas permukaan yang berinteraksi dengan pelarut sehingga lebih banyak senyawa yang dapat terekstrak. Serbuk yang diperoleh dari 5 kg daun sirih merah segar diperoleh sebanyak 889,926 gram.
Sampel yang telah berbentuk serbuk kering kemudian ekstraksi dengan metode maserasi menggunakan 4 L pelarut etanol selama 2 x 24 jam menghasilkan ekstrak encer berwarna hijau kehitaman sebanyak 2 L. Etanol merupakan pelarut universal yang baik untuk ekstraksi semua golongan senyawa metabolit sekunder (Kristanti, 2008). Ekstrak hasil maserasi kemudian diekstraksi cair-cair dengan pelarut heksana dan dihasilkan ekstrak etanol berwarna hijau pekat. Pelarut untuk ekstraksi mempunyai kepolaran yang berbeda. Hal ini disebabkan kandungan kimia dari suatu tumbuhan hanya dapat terlarut pada pelarut yang sama kepolarannya, sehingga suatu golongan senyawa dapat dipisahkan dari senyawa lainnya (Kochhar, 1990).
Ekstraksi cair-cair menggunakan corong pisah bertujuan untuk meminimalisir senyawa non polar yang terkandung dalam ekstrak etanol.
commit to user
Selanjutnya ekstrak polar hasil ekstraksi cair-cair diuapkan dengan rotary evaporator menghasilkan ekstrak etanol kental sebanyak 45,159 gram dengan rendemen 5,07%. Ekstrak etanol kental ini digunakan sebagai sampel pada prosedur kerja selanjutnya.
C. Pengujian Golongan Senyawa Ekstrak Etanol
Ekstrak etanol kental yang diperoleh dilakukan uji pendahuluan atau skrinning fitokimia untuk mengetahui golongan senyawa apa saja yang terkandung didalam ekstrak etanol. Skrinning fitokimia dilakukan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Golongan senyawa yang diuji adalah saponin, senyawa fenolik, alkaloid, flavonoid, kumarin, steroid, antrakuinon, asam lemak dan terpenoid. Skrinning fitokimia yang dilakukan terhadap ekstrak etanol dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil Skrinning Fitokimia Senyawa Kimia Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav )
Kandungan Senyawa
Hasil Uji KLT Deteksi
semprot Kesi mpul an Rf Sinar Tampak UV254nm UV365nm Hasil Uji Teori Hasi l Uji Teori Hasil Uji Teori Senyawa fenolik* 0,7 2 Hijau Hijau, biru/hita m - - - - FeCl3 1% + Saponin* 0,1 1 Ungu Merah, ungu - - - - SbCl3 20% + Flavonoid* 0,9 Hijau-kuning - - Fluorosen s biru tua Hijau Kuning, biru, hijau - + Antrakuinon * 0,2 Kunin g Kuning - - - Fluorosen s kuning KOH 5% + Kumarin* - Hijau muda Biru muda - - - - KOH 5% - Alkaloid* 0,0 6
Coklat Coklat - - Fluorose
ns kuning Fluorosen s kuning/bir u Dragendorf f + Asam lemak** 0,4 0,5 8 - - Ung u Ungu - - Rhodamin B +
commit to user dan steroid** 2 0,3 3 u Buchard dan SbCl3 Keterangan:
(+) = Ada golongan senyawa kimia * = Wagner, 1983 (-) = Tidak ada golongan senyawa kimia ** = Harborne, 1996
Hasil uji KLT ekstrak etanol daun sirih merah seperti yang tercantum dalam Tabel 2 menunjukkan bahwa ekstrak etanol mengandung senyawa golongan senyawa fenolik, alkaloid, saponin, flavonoid, steroid, alkaloid, antrakuinon, terpenoid, dan asam lemak. Komponen kimia dari suatu tanaman tergantung dari daerah geografi, umur tanaman, iklim lokal, musim dan perbedaan genetik (Yuksel, et al, 2006).
D. Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol
Ekstrak etanol kental yang diperoleh kemudian dilakukan pengujian aktvitas antibakteri menggunakan 4 bakteri uji yaitu Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Eschericia coli dan Pseudomonas aeruginosa. Metode yang digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri adalah metode perforasi dengan diameter lubang 6 mm. Dasar pengamatan dari metode ini adalah terbentuk atau tidaknya zona bening disekitar sumuran setelah media agar yang ditanami bakteri diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam, sehingga besarnya penghambatan terhadap bakteri uji dapat teramati dengan jelas. Ekstrak etanol kental dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO) dengan konsentrasi 100%, 75%, 50% dan 25%. Sampel dilarutkan dalam DMSO karena DMSO dapat melarutkan secara sempurna ekstrak etanol dan merupakan kontrol negatif. Hasil pengujian aktivitas antibakteri dapat dilihat pada Tabel 3, sedangkan pengujian selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 4.
Tabel 3. Hasil pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav ) terhadap 4 bakteri uji
Bakteri Diameter Hambat Rata-Rata
Konsentrasi 100% Konsentrasi 75% Konsentrasi 50% Konsentrasi 25% E. coli 11,29±0,08 10,90±0,05 9,75±0,05 8,80±0,24 S. aureus 11,62±0,09 10,52±0,09 9,59±0,06 8,15±0,10
commit to user
B. cereus 11,74±0,03 9,55±0,14 8,64±0,09 7,90±0,04 P. aeruginosa 11,64±0,13 8,27±0,06 8,00±0,05 7,62±0,11 Keterangan: Diameter lubang = 6 mm dengan 3 kali pengulangan
Hasil uji menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun sirih merah menunjukkan penghambatan terhadap keempat bakteri uji. Ekstrak etanol pada konsentrasi 100% termasuk mempunyai aktivitas yang kuat karena diameter penghambatannya lebih dari 10 mm. Hasil tersebut juga menunjukkan bahwa meningkatnya konsentrasi ekstrak juga meningkatkan diameter daerah hambat pertumbuhan. Hal ini disebabkan oleh meningkatnya senyawa-senyawa kimia yang bersifat antibakteri (Sumarnie, 1999).
Ekstrak etanol mengandung senyawa fenolat, alkaloid, saponin, flavonoid dan terpenoid yang secara teori telah terbukti aktif sebagai senyawa antibakteri. Flavonoid dapat membentuk kompleks dengan dinding sel bakteri dengan merusak membran mikroba. Senyawa fenolat dapat menyebabkan denaturasi protein melalui proses adsorpsi dengan melibatkan ikatan hidrogen. Pada kadar rendah, terbentuk kompleks protein-fenol dengan ikatan lemah dan segera mengalami peruraian, diikuti penetrasi fenol ke dalam sel dan menyebabkan presipitasi serta denaturasi protein. Pada kadar tinggi, fenol menyebabkan koagulasi protein dan membran sel mengalami lisis, mengubah permeabilitas membran bakteri (Siswandono dan Soekardjo, 2000).
Hasil pengujian aktivitas antibakteri terhadap ekstrak etanol selanjutnya dilakukan analisis data secara statistik untuk mengetahui secara pasti apakah terdapat perbedaan aktivitas antibakteri yang nyata diantara keempat konsentrasi ekstrak etanol diatas. Metode analisa yang digunakan adalah metode One Way Anova. Data hasil analisa dapat dilihat pada Lampiran 5. Berdasarkan hasil analisis statistik dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan yang nyata antara konsentrasi 100%, 75%, 50%, dan 25% (sig < 0,05). Selanjutnya untuk mengetahui perbedaan aktivitas antibakteri antar bakteri dilakukan pengujian lebih lanjut dengan menggunakan metode LSD. Dari data diperoleh bahwa untuk konsentrasi 100% bakteri E. coli menunjukkan perbedaan aktivitas yang nyata terhadap semua bakteri uji yang lain. Konsentrasi 75% dan 50% bakteri
commit to user
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus dan Pseudomonas aeruginosa menunjukkan perbedaan yang nyata terhadap semua bakteri uji yang lain.
Ekstrak etanol kemudian dilakukan pemisahan menggunakan Kromatografi Vakum Cair dengan pelarut organik yang semakin meningkat kepolarannya. Pemisahan dilakukan untuk mendapatkan fraksi yang mempunyai kepolaran berbeda sehingga dapat diketahui fraksi apa yang memiliki aktivitas antibakteri tertinggi.
E. Pemisahan Ekstrak Etanol
Ekstrak etanol kental dipisahkan dengan cara pemisahan menggunakan Kromatografi Vakum Cair (KVC) untuk mendapatkan fraksi dengan tingkat kepolaran yang semakin meningkat. Kromatografi Vakum Cair merupakan salah satu kromatografi kolom khusus yang biasanya juga menggunakan silika gel sebagai adsorben (Kristanti, 2008).
Sebanyak 10 gram ekstrak etanol kental dipisahkan dengan menggunakan eluen atau pelarut organik secara berurutan yaitu heksana, etil asetat dan etanol, dimana nantinya berdasarkan prinsip like dissolve like maka senyawa yang kurang polar akan larut dalam eluen yang kurang polar dan senyawa yang kepolarannya lebih tinggi akan larut dalam eluen yang lebih polar. Pemisahan ekstrak etanol dapat dijelaskan sebagai berikut:
1. Elusi dengan menggunakan eluen heksana
Pemisahan ini dilakukan dengan mengelusi ekstrak etanol secara bertahap @100 ml dengan eluen heksana sebanyak 4 kali. Hasil elusi menghasilkan eluat berwarna kuning oranye. Heksana merupakan pelarut organik yang memilki kepolaran rendah, sehingga senyawa yang kurang polar juga akan terelusi dalam pelarut heksana. Hasil pemisahan menunjukkan bahwa fraksi heksana yang diperoleh lebih sedikit. Hal ini dimungkinkan karena senyawa yang kepolarannya rendah telah terikat pada saat ekstraksi cair-cair dengan corong pisah.
2. Elusi dengan menggunakan eluen etil asetat
Elusi selanjutnya menggunakan eluen etil asetat sebanyak @100 ml sebanyak 3 kali. Hasil elusi menghasilkan eluat yang berwarna hijau. Hasil
commit to user
pemisahan didapatkan fraksi etil asetat yang jauh lebih besar dari fraksi heksana. Hal ini disebabkan etil asetat merupakan eluen yang kepolarannya lebih tinggi dibandingkan dengan heksana dan lebih rendah dibandingkan dengan etanol, sehingga senyawa yang kepolarannya sedang akan larut dalam etil asetat.
3. Elusi dengan menggunakan eluen etanol
Elusi terakhir menggunakan eluen etanol sebanyak @100 ml sebanyak 3 kali. Hasil elusi menghasilkan fraksi etanol berwarna hijau. Etanol merupakan senyawa paling polar diantara heksana dan etil asetat sehingga mudah melarutkan senyawa yang kepolarannya tinggi dalam kolom.
Eluat hasil KVC dievaporasi dengan rotary evaporator menghasilkan fraksi-fraksi kental. Fraksi-fraksi tersebut kemudian diuji aktivitas antibakterinya masing-masing terhadap bakteri uji yang dapat dihambat oleh ekstrak etanol. Pengujian dilakukan untuk mengetahui fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi. Hasil pemisahan dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4. Hasil Kromatografi Vakum Cair Ekstrak Etanol Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)
Pelarut Berat fraksi (g) Warna Persentase (%)*
Heksana 0,102 Kuning oranye 1,02%
Etil asetat 3,536 Hijau 35,36%
Etanol 4,236 Hijau 42,36%
Keterangan: *: Dari berat ekstrak etanol yang dipisahkan
F. Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi-Fraksi Hasil Pemisahan