BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
D. Prosedur penelitian
Sampel daun sirih merah diperoleh dari daerah Magelang. Daun sirih merah sebelumnya diidentifikasi oleh Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada. Daun sirih merah dibersihkan, dicuci, kemudian dikeringkan pada suhu kamar atau diangin-anginkan kurang lebih 1 hari dan dioven pada 40°C. Selanjutnya daun sirih merah diblender sampai berbentuk serbuk. Bahan kering simplisia disimpan dalam wadah tertutup.
2. Ekstraksi Maserasi Sampel Daun Sirih Merah
Daun sirih merah dimaserasi dengan pelarut etanol selama 2x24 jam. Selanjutnya ekstrak etanol diekstraksi partisi menggunakan pelarut heksana dengan corong pisah untuk mendapatkan ekstrak polarnya. Ekstrak etanol hasil partisi kemudian diuapkan pelarutnya dengan penguap vakum putar dengan suhu 50°C hingga diperoleh ekstrak etanol kental.
3. Pengujian Golongan Senyawa Ekstrak Etanol
Skrining fitokimia dilakukan terhadap ekstrak etanol awal. Hal ini bertujuan untuk mengetahui golongan senyawa yang telah terisolasi. Penapisan fitokimia dilakukan dengan metode uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
a. Uji Flavonoid
Ekstrak sampel ditotolkan pada lempeng plat Silika Gel F254. Elusi dilakukan dengan fase gerak etil asetat : asam formiat : asam asetat : air (100 : 11 : 11 : 27) dalam 2 ml. Kemudian plat diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan UV 365 nm. Flavonoid akan memberikan warna fluorosens biru tua pada UV 254 nm dan pada UV 365 nm akan memberikan warna kuning, biru dan hijau.
b. Uji Antrakuinon
Uji Antrakuinon menggunakan fase diam Silika Gel F254. Elusi dilakukan dengan fase gerak eril asetat : metanol : air (100 : 13,5 : 10) dalam 2 ml. Plat dikeringkan kemudian disemprot dengan pereaksi KOH etanolik 5%. Kemudian plat diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan UV 365 nm. Antrakuinon akan
commit to user
memberikan warna kuning pada cahaya tampak dan fluorosens kuning jika diamati pada UV 365 nm.
c. Uji Kumarin
Uji Kumarin menggunakan penyemprot KOH 5% etanolik sebagai deteksi dengan laruta pengembang dietil eter : toluen (1 : 1) dalam 2 ml yang dijenuhkan dengan asam asetat 10%. Kumarin akan menunjukkan warna biru muda jika diamati pada cahaya tampak.
d. Uji Senyawa Fenolik
Uji senyawa fenolik menggunakan penyemprot FeCl3 1% dan elusi dilakukan dengan fase gerak etil asetat : metanol : air (100 : 13,5 : 10) dalam 2 ml. Kemudian plat diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan UV 365 nm. Fenol akan memberikan warna hijau atau biru kehitaman jika diamati pada cahaya tampak.
e. Uji Saponin
Uji KLT untuk saponin dilakukan dengan fase gerak kloroform : metanol : air (64 : 50 : 10) dalam 2 ml. Plat dikeringkan kemudian disemprot dengan pereaksi SbCl3 20%. Plat kemudian diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm dan UV 365 nm. Saponin akan memberikan warna merah atau ungu jika diamati pada cahaya tampak.
f. Uji Alkaloid
Fase gerak yang digunakan adalah toluena : etil asetat : dietil amin (7 : 2 : 1) dalam 2 ml. Plat KLT dideteksi semprot dengan menggunakan pereaksi Dragendorff. Plat kemudian diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm dan UV 365 nm. Alkaloid akan memberikan warna coklat dibawah sinar tampak dan pada UV 365 nm akan memberikan warna fluorosens kuning atau biru.
g. Uji Asam Lemak
Uji KLT asam lemak menggunakan penyemrot rhodamin B dalam etanol dan fase gerak benzena : dietil eter (95% : 5%) dalam 2 ml larutan. Semua jenis asam lemak dapat dideteksi dengan rhodamin B. Plat kemudian diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan UV 365 nm. Plat akan menunjukkan warna ungu jika sampel mengandung asam lemak pada UV 254 dan 365 nm.
commit to user
h. Uji Terpenoid dan Steroid
Fase pengembang yang digunakan untuk analisa steroid dan terpenoid adalah heksana : etil asetat (95% : 5%) dalam 2 ml. Reagen penyemprot untuk steroid adalah SbCl3 dalam kloroform, sedangkan untuk terpenoid adalah larutan Lieberman Buchard. Steroid dan terpenoid akan memberikan warna ungu jika diamati pada cahaya tampak dan dibawah sinar UV 254 nm.
4. Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol
Ekstrak etanol dibuat konsentrasi tertentu dengan pelarut dimetil sulfoksida (DMSO). Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi lubang dengan tahap kerja sebagai berikut:
a. Sterilisasi alat
Alat yang digunakan untuk aktivitas antibakteri disterilkan dalam autoklaf dengan temperatur 121ºC selama kurang lebih 20 menit.
b. Pembuatan media agar miring
Sebanyak 20 gram NA (Nutrien Agar) dilarutkan dalam 1 L akuades, kemudian dipanaskan dengan stirer sampai warna kuning bening. Larutan NA kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 ml. Tabung reaksi ditutup dengan kapas dan alumunium foil lalu disterilisasi pada suhu 121ºC selama 20 menit. Tabung reaksi ditempatkan ditempat yang miring dan didiamkan sampai padat pada suhu kamar.
c. Pembuatan biakan bakteri
Bakteri uji ditempelkan pada media miring agar NA dengan pola zig zag, masing-masing bakteri dibuat 3 biakan bakteri dan dilakukan dalam keadaan steril pada ruang isolasi dengan sinar UV. Biakan diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 1 hari untuk semua bakteri uji.
d. Penyediaan suspensi bakteri uji
Untuk membuat suspensi bakteri, ambil 1 ose bakteri kemudian dimasukkan ke dalam 3 ml dalam aquades steril, dengan catatan 1 tabung untuk 1 bakteri. Larutan diaduk sampai keruh, lalu ditutup dengan kapas.
commit to user
e. Uji antibakteri
Sebanyak 1 gram NA dilarutkan dalam aquades 50 ml dan dipanaskan sampai kuning bening. Larutan NA kemudian dimasukkan ke dalam botol duran masing-masing sebanyak 15 ml. 100 µl suspensi bakteri diambil lalu taruh dalam cawan petri yang steril. Ke dalam cawan petri yang berisi suspensi bakteri, kemudian dituangkan media NA steril sebanyak 15 ml dalam suhu tubuh sekitar 30-37ºC (tidak terlalu panas dan tidak terlalu dingin), cawan petri digoyangkan sehingga kedua larutan tercampur rata. Campuran tersebut didiamkan sampai beku ( ±15 menit). Setelah itu, dibuat lubang dengan ukuran 6 mm dengan alat pervorator dan spatula. Lubang tersebut diisi dengan 20 µl sampel yang telah dicampur dengan DMSO. Cawan petri dibungkus kembali dengan kertas dan diinkubasi selama 1 hari pada suhu 37ºC.
5. Pemisahan Ekstrak Etanol
Ekstrak etanol kental dilakukan pemisahan dengan menggunakan Kromatografi Vakum Cair (KVC). Kolom KVC yang digunakan memiliki diameter 6 cm. Sebelum melakukan pemisahan dilakukan persiapan kolom KVC dan persiapan sampel. Silika gel F254 sebanyak 60 gram dimasukkan kedalam kolom kromatografi sampai padat dengan cara ditekan-tekan. Sampel sebanyak 10 gram dicampur dengan silika adsorb sebanyak 10 gram sampai tercampur rata. Apabila sampel dan silika gel F254 sulit homogen, maka ditambahkan aseton perlahan-lahan sampai kedua bahan tersebut tercampur rata. Setelah homogen, sampel dibiarkan beberapa saat sampai kering.
Sampel ekstrak etanol kering kemudian dimasukkan kedalam kolom kromatografi yang telah diisi dengan silika gel F254. Eluen utuk proses elusi pertama adalah heksana, yang dilanjutkan dengan etil asetat dan terakhir etanol untuk mendapatkan fraksi heksana, fraksi etil asetat dan fraksi etanol. Eluen yang digunakan sebanyak 400 ml heksana, 300 ml etil asetat dan 300 ml etanol. Pemisahan ekstrak etanol dilakukan 3 kali untuk mendapatkan fraksi-fraksi yang lebih banyak.
commit to user
Fraksi heksana, etil asetat dan etanol yang diperoleh kemudian diuapkan pelarutnya dengan penguap vakum putar dengan suhu 40°C hingga diperoleh fraksi heksana kental, fraksi etil asetat kental dan fraksi etanol kental.
6. Pengujian Aktivitas Antibakteri terhadap Fraksi-Fraksi Hasil Pemisahan a. Uji aktivitas fraksi-fraksi hasil KVC
Fraksi-fraksi yang didapat dilakukan pengujian antibakteri menggunakan tahapan kerja seperti pada pengujian pada ekstrak etanol untuk mendapatkan fraksi teraktif antibakteri.
b. Penetapan KHM fraksi teraktif antibakteri
Penetapan KHM dilakukan untuk mengetahui konsentrasi terendah sampel uji yang masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Penetapan KHM dilakukan dengan metode perforasi sama seperti pengujian antibakteri dengan melakukan variasi konsentrasi sampel. KHM dilakukan terhadap fraksi hasil KVC yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi.
c. Penetapan KHM amoksisilin
Konsentrasi Hambat Minimum amoksisilin murni ditetetapkan dengan cara yang sama dengan penetapan KHM fraksi teraktif antibakteri.
7. Pengujian Golongan Fraksi Teraktif Antibakteri
Pengujian golongan senyawa fraksi teraktif antibakteri sama seperti pengujian yang dilakukan pada ekstrak etanol.
8. Kromatografi Gas-Spektrometer Massa (GC-MS)
Uji GC-MS dilakukan untuk megidentifikasi komponen fraksi teraktif antibakteri daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav. ). Kondisi alat GC-MS dapat dilihat pada Lampiran 14a.
commit to user