METODE PENELITIAN
PETA LOKASI PENELITIAN
LEGENDA : Lokasi I Lokasi II
Tabel 3 Keadaan umum lokasi tempat tumbuh Gyrinops verstegii asal Papua No. Variabel Data Manokwari Kebar 1. Curah hujan (mm/Thn) 2.688 2.383 2. Kelembaban udara (%) 81 82,97 3. Suhu Udara (0C) 31,50 27,50 4. Ketinggian tempat (m dpl) 100-300 >500 5. Topografi Datar – bergelombang Datar - bergelombang 6. Kemiringan (0-25%) (> 25 %) 7. Jenis tanah Podsolik merah kuning Podsolik merah kuning 8. Jarak antar Induk Tanaman (m) 460 255
9. Jarak antar induk dan anakan(m) 2,5 1,8 10. Jumlah tanaman induk 11 20
11. Jumlah anakan 34 49
Sumber: 1-7 = BPS (2008)
8-11 = Hasil pengamatan 2009
Bahan dan Alat Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun tanaman Gyrinops verstegii baik dari induk tanaman maupun anakan seperti terlihat dalam Gambar 4. Untuk proses ekstraksi, bahan kimia yang digunakan adalah buffer ekstrak, PVP 2%, Chloroform IAA, phenol, isopropanol dingin, NaCl, Etanol 95%, buffer TE, aquabidest, H2O, primer random (OPO dan OPY), primer mikrosatelit (Tabel 4), Qiagen Taq polymerase, agarose, buffer TAE 1x, blue juice 10x, marker, Etidium bromida.
Acrilamide, APS, Temed, Formalin, NaOH, NH4OH, Asetat 1 %, Amonia, AgNO3.
Sedangkan alat yang digunakan adalah sarung tangan karet, gunting, tube 1.5 ml, tube 0,2 ml spidol permanen, mortar, pestel, pipet mikro, tips, rak tube, vortex, mesin sentrifugasi, waterbath, freezer, timbangan analitik, desikator, mesin PCR, bak elektroforesis, cetakan agar, microwave, gelas ukur, ultraviolet transilluminator, alat foto DNA
Prosedur Penelitian Pengambilan Sampel
Prosedur pengambilan sampel dilapangan adalah sebagai berikut (Yunanto 2006) :
1. Daun diambil dari setiap individu baik pada populasi pohon maupun tingkat anakan sebanyak 2 – 5 lembar daun.
2. Daun tersebut selanjutnya dimasukkan kedalam plastik klips yang berisi silika gel dengan perbandingan 1 : 5 (v/v)
3. Dalam satu lokasi diharapkan dapat dijumpai 10 hingga 20 pohon demikian pula dengan jumlah anakan pada tiap-tiap pohon
4. Setiap pohon yang daunnya diambil diukur tinggi, diameter dan letak geografisnya dengan menggunakan alat ukur, sedang untuk tingkat anakan akan diukur jarak tumbuhnya dari pohon induk
5. Data mengenai tinggi, diameter dan letak geografis, serta pemetaan pohon induk maupun anakan dicatat kedalam lembar data (datasheet).
Ekstraksi DNA
Metode yang digunakan untuk ekstraksi DNA ini adalah metode CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) yang telah dimodifikasi (Murray & Thompson 1980). Sebagian besar metode untuk ekstraksi DNA dari jaringan tanaman yang terdapat dalam literatur, memerlukan waktu yang lama dan bahan kimia yang mahal seperti chesium khlorida sehingga kurang efisien (Brown 1991).
Daun dipotong dengan ukuran 2 X 2 cm, kemudian digerus dengan menambahkan nitrogen cair di dalam pestel/mortar yang bersih. Hasil gerusan kemudian dimasukkan kedalam tabung mikro 2 ml dan ditambahkan larutan penyangga sebanyak 500 – 700 µl. Agar daun hasil gerusan tercampur dengan larutan penyangga dan PVP 2% secara merata
maka tabung yang berisi hasil gerusan tersebut di vortex. Setelah itu diinkubasi dalam dalam water bath selama 45 menit – 1 jam sambil dibolak-balik setiap 15 menit. Suhu optimal yang digunakan dalam proses inkubasi berkisar antara 65-700C. Apabila proses inkubasi melebihi suhu optimal maka DNA yang ada dalam tube akan rusak.
Setelah proses inkubasi, tabung mikro tersebut diangkat dan didinginkan selama 15 menit kemudian ditambahkan kloroform sebanyak 500 µl dan fenol sebanyak 10 µl, lalu sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit. Hasil sentrifugasi (supernatan) akan terpisah menjadi dua fase yaitu bagian atas merupakan fase air yang berisi asam nukleat dan bagian bawah yaitu fase organik yang berisi pelarut organik. Fase air dipisahkan dari fase organik dengan menggunakan pipet mikro lalu dipindahkan kedalam tabung mikro baru. Kemudian ditambahkan chloroform dan fenol sebanyak dua kali yang bertujuan untuk memperoleh DNA yang memiliki tingkat kemurnian tinggi.
Supernatan yang telah terpisah dari fase organik, ditambahkan isoproponal dingin sebanyak 500 µl dan NaCl atau NaOAc sebanyak 300 µl. Campuran ini disimpan dalam freezer selama 45 menit – 1 jam. Hasil pengendapan tersebut disentrifuge pada kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit kemudian cairan dalam tabung mikro dibuang. Hasil pengendapan akan berupa pelet DNA. Pelet DNA ini kemudian ditambahkan etanol 300 µl dan disentrifuge selama 2 menit pada kecepatan 13.000 rpm, kemudian cairan etanol tersebut dibuang. Setelah itu pelet DNA yang tersisa dalam tabung mikro dikeringkan dalam desikator dengan posisi terbalik selama 10 menit lalu ditambahkan larutan TE sebanyak 20 µl difortex kemudian disimpan didalam freezer.
Selama proses pengeringan pelet DNA, disiapkan agarose 1 % (0,33 gram agarose dalam 33 ml TAE). Untuk proses elektroforesis, diambil 3 µl DNA ditambahkan 2 µl blue juice 10 X dan kemudian di running pada tegangan 100 volt selama ± 30 menit. DNA akan bergerak kearah positif (anoda). Hasil elektroforesis kemudian direndam dalam larutan etidium Bromide (ETBR) 10 µl per 200 ml aquades selama 3 – 5 menit dan selanjutnya dilihat pada UV transiluminator.
Seleksi Primer
Primer adalah rantai pendek DNA yang dihasilkan secara buatan biasanya antara 10 – 25 nukleotida (Finkeldey 2005). Primer berfungsi sebagai titik mula terjadinya
sintesis oleh enzim yang disebut DNA polymerase yang diperoleh dari bakteri Thermus aquaticus. Enzim ini biasa disebut juga Taq DNA polymerase. Enzim ini sesuai untuk proses amplifikasi karena dapat bertahan pada suhu tinggi hingga 950C meskipun suhu optimum bagi aktifitas enzim adalah 720C. Setelah terjadi annealing selanjutnya dilakukan perbanyakan fragmen DNA melalui proses ekstensi pada suhu 720C.
Seleksi primer dimaksudkan untuk mencari primer acak yang menghasilkan penanda polimorfik, karena tidak semua primer nukleotida dapat menghasilkan produk amplifikasi (primer positif) dan dari primer positif tidak semuanya menghasilkan fragmen DNA polimorfik. Proses penyeleksian primer yang digunakan dalam metoda RAPD mengikuti primer yang pernah diuji oleh Azwin (2007), karena belum ada penelitian pendahuluan terhadap jenis Gyrinops verstegii yang dapat mengamplifikasi DNA tanaman ini. Dalam penelitian ini digunakan 5 primer yang dipilih dari golongan OPO dan 5 primer dari golongan OPY yang diproduksi oleh Operon Technology (Tabel 4).
Tabel 4 Primer golongan OPO dan OPY dalam metode RAPD
No. Primer Urutan Basa No. Primer Urutan Basa
1. OPO-06 5’CCACGGGAAG’3 1. OPY-02 5’CATCGCCGCA’3
2. OPO-09 5’TCCCACGCAA’3 2. OPY-06 5’AAGGCTCACC’3
3. OPO-10 5’TCAGAGCGCC’3 3. OPY-08 5’AGGCAGAGCA’3
4. OPO-14 5’AGCATGGCTC’3 4. OPY-09 5’GTGACCGAGT’3
5. OPO-18 5’CTCGCTATCC’3 5. OPY-11 5’AGACGATGGG’3
Pengujian dengan primer mikrosatelit, didasarkan dari hasil penelitian terdahulu yang dilakukan oleh Eurlings dan Gravendeel (2006) (Tabel 5).
Tabel 5 Daftar primer Mikrosatelit yang digunakan dalam penelitian
Nama Primer Ulangan yang diamplifikasi Sekuen Primer
1. 10 PA17F 2. 10 PA17R-H EX 3. 14PA17F 4. 14 PA17R 5. 16PA17-f2 6. 16PA17-5FAM (CA)12 (CA)12 (CA)7 (CA)7 (CA)19 (CA)19 CACACACTGTTATGGTCTACAGCTT TTCGCCATCTCATAATATTCTAATGTA CGCATATAGAAGCAATCAAAGAGC ATTTGGAATTTTACACCCATTGGA AGTGAACAACTTGACTAGGCTTG GCTGAACACAACAAGATATCACC
Nama Primer Ulangan yang diamplifikasi Sekuen Primer 7. 6PA18F 8. 6PA18R-FAM (CA)8 (CA)8 TGAGGCGTGAGTGAGATATTGATT CCTTCCTCTCTTCTTACCTCACCA
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Proses PCR membutuhkan 4 komponen utama yaitu H2O, HotStar Mix, primer
dan DNA. DNA hasil proses ektraksi sebelum dilakukan proses amplifikasi PCR harus dilakukan pengenceran dengan menggunakan aquabidest. Besarnya perbandingan antara DNA dengan aquabidest tergantung dari tebal dan tipisnya DNA hasil ekstraksi.
Untuk proses PCR, DNA 1,5 µl dicampurkan dengan HotStar Mix 7,5 µl,
Nuclease-free water 2,5 µl dan primer 1,5 µl) disentrifugasi selama 5-10 detik kemudian dimasukkan kedalam mesin PCR. Tahapan serta suhu PCR seperti disajikan dalam Tabel 6.
Tabel 6 Tahapan dalam proses PCR
Metode Tahapan Suhu (0C) Waktu (menit) Jumlah siklus RAPD Pre- Denaturation
Denaturation Annealing Extention Final Extention 95 95 37 72 72 10 1 3 2 10 1 35 1 Mikrosatelit Pre- Denaturation
Denaturation Annealing Extention Final Extention 95 95 53 72 72 2 1 2 2 5 1 35 1
Pengujian polimorfisme dilakukan dengan melihat pita hasil PCR yang divisualisasi berdasarkan hasil elektroforesis. Hasil pengujian ini dikatakan polimorfisme jika pola pita yang dihasilkan mempunyai sekurang-kurangnya lebih dari satu variasi, sedang hasil pengujian dikatakan monomorfik jika tidak memperlihatkan adanya variasi pada pola pita hasil elektroforesis.
Analisis Data
Hasil PCR yang telah dielektroforesis difoto dan dianalisis dengan melakukan skoring pita yang muncul. Pada metode RAPD pola pita yang muncul diterjemahkan
kedalam data biner berdasarkan ada atau tidak adanya pita sedang untuk data mikrosatelit dihitung berdasarkan banyaknya alel yang ditemukan sesuai panjang basa. Contoh proses skoring dapat dilihat pada Gambar 5.
Lokus Individu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 L-1 L-2 L-3 L-4 Lokus Individu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Lokus 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 Lokus 2 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 Lokus 3 0 1 0 1 1 1 0 1 0 1 Lokus 4 1 0 1 1 0 1 1 0 0 1
Gambar 5 Cara penilaian pita dengan sistim skoring
Keterangan : 1= ada pita, 0 = tidak ada pita
Hasil perhitungan pita-pita DNA tersebut kemudian dianalisis untuk mengetahui keragaman dalam populasi maupun antar populasi. Parameter keragaman genetik yang dihitung dalam penelitian ini adalah;
a. Persentase Lokus Polimorfik (PLP)
Suatu lokus gen dikatakan polimorfik jika sekurang-kurangnya ada dua varian yang berbeda (alel). Sedang untuk monomorfik tidak memperlihatkan variasi genetik. Persentase lokus polimorfik dihitung dengan rumus;
Persentase Lokus Polimorfik (PLP) =
∑
(∑
)+∑
( ) ) ( LM LP LP X 100%dimana Σ (LP) ; jumlah lokus polimorfik Σ(LM) ; jumlah lokus monomorfik
b. Jumlah alel yang teramati (na) =
∑∑
Lokus Alel
c. Jumlah alel yang efektif (ne) =
∑
ipi2
1
dimana, pi ; frekuensi genetik tipe ke i
d. Heterozigositas harapan (He) = 1 –
∑
i
pi2
dimana ; pi = frekuensi genetik tipe ke i
e. Diferensiasi genetik (Gst) =
HT HS
HT )
( − dimana; HT = keragaman populasi total
HS = keragaman populasi tunggal
Parameter keragaman genetik yang diukur seperti jumlah alel yang diamati (na), jumlah alel yang efektif (ne), jumlah lokus polimorfik, persen lokus polimorfik (PLP) dan heterozigitas harapan (He), diolah dengan software Pop Gene 1.32. Jarak genetika antara
populasi dihitung menggunakan koefisien Dice dan pembuatan dendogram menggunakan unweighted pair-group method arithmetic (UPGMA) berdasarkan jarak genetik Nei dengan perangkat lunak numerikcal taxonomy and multivariate system (NTSYS) versi 1.80 (Rohlf 1993 dalam Hannum et al. 2003). Analisis lanjutan mengenai sumber-sumber keragaman yang terjadi dalam populasi maupun antar populasi menggunakan tabel AMOVA berdasarkan Arlequin ver 3.1 (Schneider et al. 2000).