BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.3 Populasi Penelitian
Populasi adalah Mencit jantan Mus musculus L. Strain Balb c, berumur 6-8 minggu dengan berat badan 20-50 gram, yang diperoleh dari Badan Penyidikan dan Pengujian Veteriner (BPPV) Medan.
3.4. Variabel Penelitian
3.4.1. Variabel Indipenden, yaitu Pb asetat dan Vitamin C
3.4.2 Variabel Dipenden, Enzim ALAD, Kadar Hemoglobin dan Basophilic Stippling
3.4.3 Variabel kendali, yaitu jenis kelamin, umur, berat badan, kesehatan dan lingkungan
3.5.Bahan
a. Sediaan Plumbum Aceticum (Lead acetate) dalam bentuk kristal (CH3COO)2Pb
3H2O made in Germany diencerkan dengan aquadest
b. L(+) Ascorbic Acid produk PT.Merck c. Pellet produksi PT.Mabar Feed Medan 3.6. Alat
a. Peralatan untuk pemeriksaan aktivitas enzim ALAD (Spectro Fotometer Genesis Tm20) yang terkalibrasi dengan baik
b. Peralatan untuk pemeriksaan kadar hemoglobin (Spectro Fotometer Genesis
Tm
20) yang terkalibrasi dengan baik
c. Peralatan untuk pemeriksaan hapusan darah (Pewarnaan Menurut Giemsa) d. Timbangan hewan
e. Termometer ruangan f. Spuit 1ml merek Trumo 3.7. Pelaksanaan Penelitian 3.7.1 Pemeliharaan Hewan Coba
Hewan dipelihara dalam kandang yang diberi alas sekam dan anyaman kawat sebagai penutup. Pemberian makan dan minum dilakukan setiap hari secara ad libitum. Pakan yang diberikan berupa pellet. Selanjutnya secara acak mencit
dimasukkan kedalam tiap kandang terpisah, setiap kandang diberi tanda sesuai dengan perlakuan(Kusumawati)
3.7.2. Perlakuan Hewan Coba
a. Sampel dibagi menjadi lima kelompok masing-masing kelompok terdiri dari tujuh ekor mencit, kecuali kelompok kontrol 6 ekor mencit
b. Kelompok 1 adalah kelompok kontrol yang diberi aquadest
c. Kelompok 2 adalah kelompok yang diberi perlakuan dengan timbal acetat dosis 20 mg/kgBB secara intraperitoneal selama 2 hari (Gajawat et al., 2006) d. Kelompok 3 adalah kelompok yang diberi perlakuan Vitamin C dosis 200
mg/kgBB secara oral selama 7 hari. Satu jam setelah pemberian Vitamin C pada hari ketujuh dilanjutkan dengan pemberian timbal acetat 20mg/kgBB secara intraperitoneal selama 2 hari (Klenner, 1997)
e. Kelompok 4 adalah kelompok yang diberi perlakuan Vitamin C dosis 500mg/kgBB secara oral selama 7 hari. Satu jam setelah pemberian Vitamin C pada hari ketujuh dilanjutkan dengan pemberian timbal acetat 20mg/kgBB secara intraperitoneal selama 2 hari
f. Kelompok 5 adalah kelompok yang diberi perlakuan Vitamin C dosis 1000mg/kgBB secara oral selama 7 hari. Satu jam setelah pemberian Vitamin C pada hari ketujuh dilanjutkan dengan pemberian timbal acetat dosis 20mg/kgBB secara intraperitoneal selama 2 hari
g. Dilakukan pemeriksaan kadar enzim ALAD, kadar hemoglobin,dan basophilic stippling pada mencit pada tiap kelompok penelitian, setelah itu mencit dibunuh secara dislokasi leher.
3.8. Prosedur Pemeriksaan
3.8.1. Pemeriksaam enzim ALAD
a. Pembuatan larutan pereaksi untuk pemeriksaan enzim ALAD Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam pembuatan larutan pereaksi yaitu : timbangan analitik, labu ukur 100ml, pH meter, baker glas 250ml, gelas ukur 500ml dan 100ml.
Bahan kimia yang digunakan adalah : Na2HPO412H2O, NaH2PO42H2O, ALA,
Trichloro asetat (TCA), HgCl2, Triton X 100, p-dimethylaminobenzaldehyd, asam
acetat glacial, asam perclorat, aquadest. Cara kerja
a. Larutan triton X-100
0,5 ml troton x 100 dicampur denga 500ml aquadest b. Larutan buffer natrium fosfat pH 6,2
Sebanyak 53,72 g Na2HPO412H2O ditimbang dilarutkan didalam 500 ml
aquadest (larutan A), NaH2PO42H2O 23,4 dilarutkan dalam 500 ml aquadest (larutan
B), selanjutnya 100ml larutan A dicampur dengan 168 ml larutan B, dilakukan pengukuran pH dengan pH meter, jika pH menunjukkan lebih besar dari 6,4, maka larutan ditambahkan asam fosfat sedikit demi sedikit hingga pH 6,4 sedang jika pH lebih rendah dar 6,4 maka larutan ditambah dengan larutan Na2PO4
c. Larutan ALA 125mmol/L
Sebanyak 209,5 mg ALA dilarutkan hingga 100mL dan disimpan dalam 40C d. Larutan Trichloro asetat(TCA) 60g/L yang mengandung HgCl2 60mmol /L 15g TCA dan 4g HgCl2 dilarutkan dengan aquadest hingga 250 mL aquadest
e. Larutan pereaksi Erlich
Timbang 2,0 g p-dimethylaminobenzaldehyd kemudian larutkan dalam 60 mL asam acetat glacial, selanjutnya tambahkan 32 mL asam perclorat 70% sambil diaduk tambahkan asam acetat hingga 100 mL (Wigfield & Farant,1981)
Prosedur penentuan aktivitas enzim ALAD dalam darah
Aktivitas enzim ALAD dilakukan sesuai metode (Wigfield&Farant, 1981),yaitu: Pipet 20µL sampel darah dengan mikropipet, dimasukkan kedalam tabung mikro tambahkan 100 µL larutan Triton X-100 campur selama 15 detik dan tempatkan campuran dalan ice-bath selama 3 menit untuk menyempurnakan lisis. Kedalam hemolisat ditambahkan 100 µL buffer natrium fosfat pH 6,4 dan 100 µL larutan Aminolevulinic Acid kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu 370C. Untuk blanko tambahkan 200 µL campuran larutan TCA merkuri klorida, inkubasi semua sampel selama 90 menit pada 37 0C. Untuk mengahiri inkubasi hentikan reaksi dengan menambahkan 200 µL campuran larutan TCA merkuri klorida, Sentrifugasi pada kecepatan 1500 rpm selama 5 menit pada Eppendorf microcentrifuge. Setelah disentifugasi pindahkan 400 µL larutan supernatan ketabung lain dan tambahkan 400 µL pereaksi Erlich. Selanjutnya untuk blanko ditambahkan 400 µL pereaksi Erlich.
400 µL aquadest. Setelah 5 menit, absorbansi diukur pada panjang gelombang 555 nm (Wigfield and Farrant, 1981)
3.8.2. Penentuan Hematokrit
Digunakan untuk menentukan aktivitas enzim ALAD a. Alat dan Bahan
Alat dan Bahan yang digunakan adalah: pipet hematolrit, centrifuger hematokrit, skala hematokrit, lilin(wax)
b. Cara Kerja
Sampel darah dimasukkan dimasukkan kedalam pipet hematokrit hingga hampir penuh(2/3 dari panjang pipet), tutup salah satu ujung pipet dengan lilin centrifuger selama 5 menit dengan kecepatan 16.000 rpm, persentase hematokrit dibaca dengan skala khusus.
3.8.3. Pemeriksaan Kadar Hemoglobin
Kadar Hemoglobin ditentukan dengan metode Fotoelektrik Cyanmethemoglobin (Gandasoebrata,1992)
a. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan : mikro pipet, spectrofotometer, tabung reaksi
Bahan yang digunakan : sampel darah dan reagen hemoglobin berupa kit dari PT. Human
b. Cara Kerja
Isi pipet dengan 20 L darah heparin, dimasukkan kedalam tabung yang telah berisi 5 mL larutan drabkin, pipet dibilas beberapa kali dengan larutan drabkin
tersebut Diamkan kurang lebih selama 10 menit pada suhu kamar, kemudian diukur serapannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. (SoebrataGanda, 1992)
3.8.5 Pemeriksaan Hapusan Darah
Pemeriksaan hapusan darah dilakukan dengan metode Giemsa (Gandasoebrata ,1992) a. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan : Objec glass, kaca pendorong(untuk membuat hapusan darah)
Bahan yang digunakan : Sampel darah dan reagen Giemsa dari PT.Merck, aquadest serta metanol.
b. Cara Kerja
Letakkan satu tetes kecil darah, pada 2-3 mm dari ujung kaca objek. Letakkan kaca penghapus dengan sudut 30-450 terhadap kaca objek didepan tetesan darah. Tarik kaca pengahapus kebelakang huingga menyentuh tetesan darah, tunggu hingga darah menyebar pada sudut tersebut. Dengan gerakan yang cepat dorong kaca penghapus hingga terbentuk hapusan darah sepanjang 3-4 cm pada kaca objek. Biarkan hapusan darah mengering diudara lalu warnai dengan pewarnaan Giemsa (SoebrataGanda, 1992)
Cara Pemeriksaan Hapusan Darah
Preparat diobservasi di bawah mikroskop dg pembesaran okuler 10 kali & objektif 100 kali, mempergunakan minyak emersidicari & dihitung gambaran
basophilik stipling yang tampak secara zig zag per lapangan pandang dalam 1000 eritrosit.
3.9. Analisa Data
Data yang diperoleh akan ditentukan distribusinya dengan menggunakan uji normalitas dari Kolmogorov-Smirnov dan Shapito –Wilk. Apabila data berdistribusi normal maka akan dilakukan uji statistik parametrik, yaitu dengan uji Anova satu arah dan bila terdapat perbedaan mean akan dilanjutkan dengan metoda LSD.