3. METODOLOG
3.4. Prosedur Analisis
Prosedur analisis yang dilakukan berdasarkan tahap-tahap metode penelitian adalah meliputi pengukuran kadar garam dan pH sampel, perhitungan Total Plate Count (TPC), isolasi bakteri dari ikan peda merah, uji sifat morfologi dan uji sifat fisiologi.
3.4.1. Pengukuran kadar garam sampel (AOAC 1995)
Sampel uji diabukan setelah sebelumnya ditimbang sebanyak 2 gram, kemudian sampel yang telah diabukan dalam cawan porselen ditambahkan akuades sampai tiga seperempat cawan. Abu dalam cawan porselen diaduk-aduk kemudian cairan tersebut ditempatkan ke dalam labu takar 100 ml dan ditambahkan akuades sampai tanda tera. Selanjutnya dari labu takar dipipet sebanyak 10 ml dan dimasukan ke dalam gelas piala 100 ml dan ditambahkan K2CrO4 (kalium kromat) 2-3 tetes. Ke dalam buret dimasukkan larutan perak nitrat 0,2 N. Kemudian campuran larutan sampel dalam beaker glass dititrasi dengan perak nitrat sampai terbentuk endapan putih (Ag2CrO4) atau berubah warna menjadi jingga. Pengukuran kadar garam ini dilakukan secara duplo. Perhitungan % NaCl adalah sebagai berikut:
% NaCl = 3 3 58,4 X100% contoh mg X fp X NAgNO X VolumeAgNO
Volume AgNO3 adalah jumlah perak nitrat yang dibutuhkan dalam titrasi dan Normalitas AgNO3 adalah 0,2
3.4.2. Pengukuran derajat keasaman (pH) sampel (AOAC 1995)
Sampel dalam wadah diukur pH-nya dengan menggunakan pH meter. Sebelum digunakan, pH meter dikalibrasi dengan menggunakan larutan buffer pH 4,31 dan 6,86. Sampel ditimbang sebanyak 1 gram yang ditambahkan 10 ml akuades lalu diblender sehingga diperoleh larutan yang homogen. Setelah itu sampel diukur pH-nya dengan menggunakan pH meter. Nilai pH diperoleh dari hasil pembacaan pada skala pH meter saat angka digital menunjukkan nilai pH konstan. Pengukuran pH ini dilakukan secara duplo.
3.4.3. Perhitungan nilai Total Plate Count (Fardiaz 1992)
Perhitungan nilai TPC digunakan untuk mengetahui mutu suatu bahan pangan. Koloni yang tumbuh dapat juga digunakan untuk isolasi serta identifikasi bakteri karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari suatu bakteri yang mempunyai penampakan pertumbuhan spesifik.
Sampel ikan peda dihancurkan dalam mortar porselen untuk mendapatkan kondisi sampel yang homogen. Selanjutnya sampel sebanyak 10 gram dimasukkan ke dalam 90 ml larutan pengencer steril secara aseptis untuk mendapatkan pengenceran 10-1. Untuk pengenceran 10-2 diambil 1 ml suspensi contoh dari tabung pengencer 10-1 dan dimasukkan ke dalam tabung pengencer yang lain yang berisi 9 ml larutan pengencer, kemudian sampel dikocok sampai homogen. Hal yang sama dilakukan sampai mendapatkan pengenceran 10-5.
Cara pemupukan dalam metode hitungan cawan dilakukan dengan metode tuang (pour plate). Dari setiap tingkat pengenceran, masing-masing diambil 1 ml suspensi sampel yang dimasukkan ke dalam cawan petri. Kemudian ke dalam cawan petri ditambahkan medium Nutrien Agar (NA) yang telah steril sebanyak 15-20 ml dan digoyangkan supaya sampel menyebar rata. Medium NA yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri ini telah ditambahkan garam (NaCl murni) yang sesuai dengan kadar garam yang terkandung di dalam sampel.
Setelah itu cawan petri diinkubasikan pada suhu kamar selama dua hari. Koloni yang tumbuh diamati dan dihitung jumlahnya untuk mendapatkan nilai Total Plate Count (TPC). Cara perhitungan TPC adalah sebagai berikut:
TPC (koloni/ml) = Jumlah koloni per cawan x
n pengencera faktor
1
3.4.4. Isolasi bakteri dari sampel (Fardiaz 1988)
Isolasi dan pemurnian bakteri bertujuan memisahkan koloni-koloni bakteri yang masih tercampur hingga diperoleh suatu isolat murni. Pada tahap pemurnian koloni bakteri yang dianggap terpisah dipisahkan dengan cara penggoresan kuadran.
Berdasarkan hasil pengamatan setelah tahap perhitungan TPC, koloni bakteri yang tampak berbeda dari koloni yang dominan masing-masing diambil untuk dikulturkan ke media NA (yang telah ditambahkan NaCl sebanyak 11,4 %)
yang berbentuk agar miring, sebelumnya dilakukan pengamatan terhadap morfologi koloni terpilih (bentuk, tepian, elevasi dan warna). Kultur bakteri bakteri tersebut diinkubasi selama dua hari pada suhu kamar (30ºC).
Isolasi atau pemurnian dilakukan pada agar cawan dengan menggunakan metode goresan kuadran. Kultur bakteri di dalam agar miring yang diperoleh setelah dilakukan uji morfologi sel (pewarnaan Gram, spora dan bentuk sel) digoreskan secara kuadran ke medium NA padat steril kemudian diinkubasi selama dua hari. Dengan metode goresan kuadran ini diharapkan akan diperoleh koloni terpisah kemudian dilakukan pengkulturan koloni terpilih pada agar miring. Selanjutnya, tabung diinkubasi pada suhu kamar selama dua hari dan dilakukan uji morfologi sel (pewarnaan Gram, spora dan bentuk sel) kembali. Isolasi dan pemurnian ini dilakukan beberapa kali sampai didapat isolat yang benar-benar murni
Setelah didapatkan koloni yang benar-benar terpisah, biakan murni tersebut ditumbuhkan atau disimpan dalam agar miring dan disegarkan secara berkala (1 minggu sekali).
3.4.5. Uji sifat morfologi
Untuk mengetahui sifat-sifat morfologi dari isolat bakteri yang diperoleh dilakukan pengamatan morfologi koloni dan morfologi selnya.
a) Morfologi koloni
Pengamatan morfologi koloni dilakukan untuk mengetahui bentuk koloni dari atas, bentuk tepi, bentuk elevasi dan warna koloni secara visual (Lampiran 1). b) Morfologi sel
Uji morfologi sel meliputi pengamatan bentuk sel, pewarnaan Gram, pewarnaan spora dan uji pergerakan bakteri atau motilitas.
Prosedur penyiapan olesan bakteri (preparat bakteri) yang baik merupakan syarat untuk melakukan pewarnaan, baik pewarnaan Gram maupun spora. Langkah pertama yaitu satu sampai dua mata ose air steril atau air suling diletakkan pada gelas obyek, lalu diambil satu sampai dua mata ose biakan bakteri kemudian dihomogenkan. Kemudian olesan dibiarkan kering oleh udara dan difiksasi dengan panas agar bakteri tersebut mati.
(1) Bentuk sel
Berdasarkan hasil preparat bakteri yang telah dibuat diamati bentuk selnya secara mikroskopik sehingga dapat diketahui bentuknya (kokus, batang atau spiral).
(2) Pewarnaan Gram (Fardiaz 1989)
Pewarnaan Gram pada bakteri dilakukan dengan cara mengamati sel-sel bakteri yang telah mati dan diwarnai. Dengan cara tersebut, bentuk sel akan menjadi lebih jelas karena warna sel dibuat kontras dengan medium disekelilingnya sehingga lebih mudah dilihat dibawah mikroskop. Bakteri yang mempunyai sel dengan ukuran relatif kecil akan mudah dilihat. Pada pewarnaan Gram diperlukan empat jenis larutan yaitu zat warna basa (kristal violet), larutan iodium (lugol), alkohol dan safranin.
Preparat bakteri ditetesi dengan pewarna kristal violet dan dibiarkan selama satu menit, kemudian dibilas dengan air. Selanjutnya preparat ditetesi dengan larutan lugol dan dibiarkan selama satu menit, dicuci dengan air dan dihilangkan warnanya menggunakan alkohol 96 % selama 10-20 detik atau sampai warna ungu tidak luntur lagi. Setelah dicuci sebentar kemudian diwarnai dengan larutan safranin dan dibiarkan selama 10-20 detik lalu dibilas dengan air, kemudian dikeringkan dan diperiksa di bawah mikroskop menggunakan minyak imersi dan diamati bentuk sel serta reaksi Gram.
Sel-sel bakteri yang tidak dapat melepaskan warna akan tetap berwarna seperti warna violet kristal yaitu biru ungu disebut bakteri Gram positif. Sel-sel bakteri yang dapat melepaskan violet kristal dan mengikat safranin sehingga berwarna merah atau merah muda disebut bakteri Gram negatif. Tahap-tahap pewarnaan Gram dapat dilihat pada Gambar 2.
Preparat bakteri pada gelas obyek
Ditetesi pewarna kristal violet, dibiarkan (1 menit), dibilas dengan air
Ditetesi larutan lugol (1 menit), dibilas dengan air
Ditetesi alkohol 96 % (10-20 detik) atau sampai warna ungu tidak luntur lagi, dibilas dengan air
Ditetesi safranin dan dibiarkan selama 10-20 detik
Dibilas dengan air dan dikeringkan
Diperiksa di bawah mikroskop dan diamati bentuk sel dan reaksi Gram
Gambar 2. Tahap-tahap pewarnaan Gram
(3) Pewarnaan spora (Hadioetomo 1985)
Pewarnaan spora merupakan pewarnaan yang bertujuan melihat adanya suatu struktur di dalam sel bakteri yang disebut endospora. Jika sel semakin tua, maka sel vegetatif akan pecah sehingga endospora akan terlepas menjadi spora bebas. Berbeda dengan sel vegetatif, spora akan lebih tahan lama dalam keadaan lingkungan yang ekstrim.
Pada prinsipnya pewarnaan ini digunakan untuk membedakan spora dari sel vegetatif. Zat warna yang biasa digunakan adalah malachite green dan safranin.
Mula-mula pewarna hijau malachit diteteskan di atas preparat bakteri dan dibiarkan hingga kering dengan pemanasan. Setelah kering, preparat dicuci hati- hati dengan air selama 20-30 detik kemudian diberi safranin dan dibiarkan selama 30 detik, dibilas dengan air dan dikeringkan dengan kertas serap. Sel kemudian diperiksa di bawah mikroskop dengan menggunakan minyak imersi. Endospora yang masih terdapat dalam sel vegetatif maupun spora bebas akan berwarna hijau
biru, sedangkan sel vegetatif akan berwarna merah sampai merah muda. Tahap- tahap pewarnaan spora dapat dilihat pada Gambar 3.
Preparat bakteri pada gelas obyek
Ditetesi pewarna hijau malachit dan dibiarkan hingga kering dengan pemanasan
Dicuci hati-hati dengan air selama 20-30 detik
Ditetesi safranin dan dibiarkan selama 30 detik
Dibilas dengan air dan dikeringkan
Diperiksa di bawah mikroskop dengan minyak imersi
Gambar 3. Tahap-tahap pewarnaan spora
(4) Uji pergerakan bakteri atau motilitas (Fardiaz 1989)
Uji motilitas merupakan uji yang digunakan untuk melihat sifat pergerakan bakteri yang dapat dilihat dengan pergerakan selnya. Sifat pergerakan ini biasanya ditandai dengan pertumbuhan yang menyebar atau tidak.
Pengujian ini dilakukan dengan cara sebagai berikut: secara aseptis menggunakan ose yang lurus bagian ujungnya, isolat bakteri ditusukkan ke dalam Nutrient Broth yang mengandung agar 0,5 % (agar lunak). Selanjutnya diinkubasikan pada suhu 35ºC selama dua hari. Bila pertumbuhan menyebar, maka bakteri tersebut bergerak atau motil, dan bila pertumbuhan bakteri tidak menyebar, hanya berupa garis saja, maka bakteri tersebut bersifat tidak bergerak (non motil).
3.4.6. Uji sifat fisiologi
Uji sifat-sifat fisiologi meliputi uji hidrolisis pati, uji hidrolisis protein, uji hidrolisis lemak, uji reduksi nitrat, uji indol, uji fermentasi gula, uji katalase, uji oksidase, uji H2S, uji oksidatif-fermentatif Baird-Parker, uji kualitatif untuk Staphylococcus, uji koagulase, uji manitol dan pendugaan jenis bakteri.
a) Uji hidrolisis pati (Lay 1994)
Pengujian hidrolisis pati bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menghasilkan enzim amilase yang dapat memecah pati menjadi molekul
yang lebih sederhana. Pengujian ini dilakukan karena banyak bakteri yang mempunyai kemampuan untuk menghidrolisis pati.
Isolat yang akan diuji digoreskan pada setengah bagian cawan yang berisi medium Starch Agar (SA), dan diinkubasikan pada suhu 30ºC selama dua hari. Pengamatan pada isolat yang diuji dilakukan dengan cara meneteskan larutan iodium pada koloni yang tumbuh. Uji aktivitas hidrolisis pati ini dikatakan positif jika tidak terbentuk warna biru sewaktu penambahan larutan iodium ke dalam media.
b) Uji hidrolisis protein (Fardiaz 1989)
Pengujian hidrolisis protein bertujuan untuk mengetahui adanya enzim proteinase ekstraseluler pada bakteri, yang dapat memecah protein menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana seperti peptida dan asam amino.
Isolat yang akan diuji digoreskan pada setengah bagian cawan yang berisi Skim Milk Agar (SMA). Inkubasi dilakukan pada suhu 30ºC selama dua hari. Uji dikatakan positif jika terbentuk areal bening disekeliling koloni.
c) Uji hidrolisis lemak (Fardiaz 1989)
Pengujian hidrolisis lemak bertujuan untuk mengetahui adanya enzim lipase pada bakteri. Enzim ini juga merupakan enzim ekstraseluler dan tergolong dalam kelompok esterase, yaitu enzim yang mampu menghidrolisis substansi yang mengandung ikatan ester. Enzim lipase akan memecah lemak menjadi asam lemak dan gliserol.
Isolat yang akan diuji digoreskan pada setengah bagian cawan yang berisi Nutrien Agar (NA) + 1% lemak + neutral red. Inkubasi dilakukan pada suhu 30ºC selama dua hari. Koloni yang dapat menghidrolisis lemak menjadi gliserol dan asam lemak akan menyebabkan terbentuknya warna merah pada bagian bawah koloni, dan hal ini menunjukkan uji aktivitas hidrolisis lemak positif.
d) Uji katalase (Fardiaz 1987)
Uji katalase digunakan untuk mengetahui adanya enzim katalase pada bakteri, dimana enzim ini berperan dalam memecah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen. Uji ini penting dilakukan untuk mengetahui sifat bakteri terhadap kebutuhan akan oksigen.
Secara aseptis diambil satu ose kultur bakteri dari agar miring dan dipindahkan pada gelas obyek. Kemudian diteteskan 1-3 tetes larutan H2O2 3 %. Adanya enzim katalase ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung kecil oksigen yang terlihat seperti busa sabun.
e) Uji reduksi nitrat (Hadioetomo 1985)
Beberapa mikroorganisme mampu menggunakan molekul bukan oksigen sebagi akseptor elektron terakhir. Nitrat yang direduksi menjadi nitrit oleh mikroorganisme tertentu digunakan sebagai akseptor elektron terakhir.
Dalam uji reduksi nitrat, isolat yang akan diuji diinokulasikan ke dalam Nitrat Broth. Setelah diinkubasi pada suhu 37ºC selama dua hari, masing-masing isolat yang akan diuji diberi tiga tetes larutan asam sulfanilat dan tiga tetes larutan dimetil-alfa-naftilamin. Bila dalam isolat yang diuji terdapat nitrit, maka akan segera terbentuk warna merah, berarti uji nitrit positif. Bila tidak jelas perubahan warnanya, dapat ditambahkan sedikit serbuk seng kedalam tabung yang berisi isolat yang diuji, dan bila terbentuk warna merah, berarti uji reduksi nitrat negatif, sedangkan bila tidak terjadi perubahan warna berarti uji reduksi nitrat positif. f) Uji indol (Hadioetomo 1985)
Uji indol digunakan untuk mengetahui adanya enzim triptofanase pada bakteri, dimana enzim triptofanase ini dapat menghidrolisis asam amino triptofan menjadi indol dan asam piruvat.
Dalam uji indol medium yang digunakan adalah medium Tryptone Broth semi padat. Isolat yang akan diuji diinokulasi ke dalam tabung reaksi yang berisi Tryptone Broth semi padat dan diinkubasi pada suhu 35ºC selama dua hari. Setelah inkubasi, masing-masing tabung ditambahkan 0,5 ml pereaksi Kovac’s. Uji ini dikatakan positif jika terbentuk warna merah yang menunjukkan adanya indol dalam medium.
g) Uji fermentasi gula dan H2S (Fardiaz 1989)
Uji fermentasi gula dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri untuk memfermentasi gula-gula tertentu dengan menghasilkan asam dan atau gas. Sedangkan uji H2S dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri untuk memecah sistin dan menghasilkan H2S.
Dalam uji fermentasi gula digunakan medium Triple Sugar Iron Agar (TSIA). Isolat yang akan diuji diinokulasi pada agar miring TSIA dengan cara membuat goresan pada agar miring dan menusukkannya pada bagian bawah agar. Kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC selama dua hari. Reaksi-reaksi yang terjadi dapat diamati pada Tabel 3 dan 4.
Tabel 3. Reaksi-reaksi yang terjadi pada uji fermentasi gula Bagian bawah agar Bagian atas agar
reaksi warna reaksi warna
Keterangan Basa Asam Asam Merah Kuning Kuning - Basa Asam Orange Merah kuning
Tidak memfermentasikan gula Fermentasi glukosa
Fermentasi laktosa dan atau sukrosa
Sumber: Fardiaz (1989)
Tabel 4. Reaksi-reaksi yang terjadi pada uji H2S
Bagian bawah agar Bagian atas agar Keterangan Agar pecah/terangkat keatas
Agar berwarna hitam
- -
Produksi gas Produksi H2S Sumber: Fardiaz (1989)
h) Uji oksidase (Hadioetomo 1985)
Uji oksidase merupakan salah satu uji yang cukup penting dalam karakterisasi bakteri. Uji oksidase berfungsi untuk menentukan oksidase sitokrom yang biasanya terdapat pada mikroorganisme patogen.
Pada uji oksidase kultur bakteri ditumbuhkan pada medium Trypticase Soy Agar (TSA) dan diinkubasi pada suhu 35ºC selama dua hari. Koloni yang tumbuh digenangi dengan pereaksi p-aminodimetil-anilin oksalat 1 %. Uji positif ditandai dengan berubahnya koloni menjadi merah muda lalu merah tua, merah gelap dan akhirnya hitam.
i) Uji oksidasi-fermentatif Baird-Parker (Baird-Parker 1969 diacu dalam Minor dan Marth 1976)
Uji ini dilakukan untuk mengetahui metabolisme dari isolat bakteri yang diuji dilakukan dengan cara oksidatif atau fermentatif terhadap karbohidrat yang ditambahkan.
Dalam uji oksidatif-fermentatif digunakan tryptone, yeast extract, glukosa, bromocresol blue dan agar. Bakteri yang akan diuji, secara aseptis dengan menggunakan ose diinokulasikan kedalam medium tegak yang sudah disiapkan terlebih dahulu. Setiap bakteri yang akan diuji ditusukkan ke dalam dua tabung, tabung pertama ditutupi dengan parafin 3-5 ml, sedangkan tabung kedua tanpa parafin. Inkubasi dilakukan pada suhu 30ºC selama 48 jam. Bila terjadi perubahan warna (terbentuk warna kuning) pada kedua tabung, maka bakteri bersifat fermentatif. Bila hanya tabung tanpa parafin yang berubah warna (terbentuk warna kuning) maka bakteri bersifat oksidatif sedangkan bila tidak terjadi perubahan warna pada kedua tabung tersebut berarti uji oksidatif- fermentatif bersifat negatif.
j) Uji kualitatif untuk Staphylococcus (Fardiaz 1989)
Uji ini digunakan untuk mengetahui dan memastikan bahwa isolat bakteri yang diperoleh tergolong dalam jenis bakteri Staphylococcus sp.
Dalam uji kualitatif untuk Staphylococcus digunakan medium Baird-Parker Agar (BPA) yang dicampur dengan Egg Yolk steril. Isolat yang
akan diujikan digoreskan pada cawan yang telah berisi medium tersebut. Inkubasi dilakukan pada suhu 37ºC selama dua hari. Uji dikatakan positif jika terbentuk koloni bakteri berwarna hitam pada medium yang terkena goresan.
k) Uji koagulase (Fardiaz 1989)
Uji ini merupakan uji lanjutan dari uji kualitatif untuk Staphylococcus. Pada uji ini akan diketahu isolat yang diuji tergolong bakteri patogen atau tidak.
Dalam uji koagulase digunakan medium cair Brain Heart Infusion (BHI). Bakteri yang akan diuji diinokulasikan dengan cara menusukkan jarum ose pada medium cair steril BHI sebanyak 5 ml kemudian dihomogenkan dengan menggunakan vortex. Inkubasi dilakukan pada suhu 37ºC selama dua hari, setelah dua hari diambil 0,2 ml kultur dan ditambahkan 0,3 ml plasma kelinci, selanjutnya diinkubasi lagi pada suhu 37ºC selama satu sampai dua jam. Uji koagulase positif ditandai dengan terbentuknya koagulasi seperti fibrin (gumpalan) yang berwarna putih bening.
l) Uji manitol (Lay 1994)
Uji ini merupakan penguat dari uji koagulase yang digunakan untuk membedakan Staphylococcus yang bersifat patogen atau tidak patogen.
Dalam uji manitol digunakan medium cair Manitol Broth + fenol red di dalam tabung durham. Bakteri yang akan diuji diinokulasikan dengan cara mengambil satu ose isolat yang kemudian dimasukkan ke dalam medium cair Manitol Broth. Inkubasi dilakukan pada suhu 30ºC selama dua hari. Uji dikatakan positif jika terjadi perubahan warna dari merah menjadi kuning. Bila bakteri tersebut Staphylococcus aureus (patogen) maka akan membentuk zona kuning sedangkan Staphylococcus yang bersifat tidak patogen akan membentuk zona merah.
m) Pendugaan jenis bakteri (Cowan 1981)
Setelah dilakukan uji morfologi dan fisiologi, kelima isolat bakteri tersebut diduga jenisnya dengan menggunakan tabel identifikasi dari Cowan (1981). Tabel identifikasi Cowan (1981) dapat dilihat pada Tabel 5 dan 6. (TABEL ADA DI MICROSOFT EXCEL)