Selection by progeny test
B. Prosedur elektroforesis horizontal DNA kelapa sawit
Running elektroforesis
Bahan kimia :
• Sampel DNA stok atau produk PCR • Loading buffer 6X
• 1 kb DNA ladder
• Larutan kerja buffer TAE 1X
Alat :
• Alat elektroforesis • Power supply
Prosedur :
• Letakkan cetakan pada camber, lalu tempatkan gel pada cetakan dengan posisi sumur gel sebelah atas menghadap kutub negative.
• Ke dalam chamber elektroforesis dituang buffer TAE 1X sampai tanda batas yang ditunjukkan pada chamber (tinggi permukaan buffer TAE kira-kira 1 cm dari permukaan gel).
• Teteskan masing-masing 2 µl loading buffer 6X pada lembaran plastik sebanyak 20 sampel dengan urutan 10 sampel bagian atas dan 10 sampel bagian bawah (sesuai dengan jumlah sumur pada gel).
• Dengan menggunakan pipet mikro, dipipet sebanyak 5 µl 1 kb DNA ladder kemudian dicampurkan dengan loading buffer pada lembaran plastik lalu dimasukkan pada sumur no 1 bagian atas gel. Hal yang sama dilakukan untuk sumur no 1 pada bagian tengah gel.
• Dengan menggunakan pipet mikro, dipipet sebanyak 5 µl DNA sampel atau PCR produk lalu dicampurkan dengan loading buffer di lembaran plastik kemudian dimasukkan pada sumur no 2. Hal yang sama dilakukan pada sumur no 3,4,5 dan seterusnya dengan sampel yang berbeda.
• Setelah semua sumur terisi dengan DNA sampel atau PCR produk chamber ditutup dengan menyesuaikan kutub (negatif dan positif) yang ada pada tutupnya.
• Kabel yang terpasang dihubungkan ke power supply (merah positif dan hitam negatif) pada port power supply.
• Power supply dihubungkan ke arus listrik lalu tombol powernya dinyalakan. • Tegangan diatur konstan pada voltase 50 volt selama 60 menit.
• Setelah waktu tercapai power supply dimatikan dan tutup chamber dibuka, kemudian gel beserta cetakan diangkat, lalu gel dilepaskan dan diletakkan pada bak plastik kecil.
Visualisasi dan dokumentasi gel
Bahan kimia :
• Larutan etidium bromide 0,05% • Gel hasil elektroforesis
• Aquades steril
Alat :
• UV transiluminator
• Kamera digital atau polaroid
Prosedur :
• Persiapkan dua buah bak plastik untuk staining dan destaining.
• Pada bak plastik untuk staining diisi 500 ml aquades steril lalu ditambahkan 500 µl ethidium bromide 0,05% kemudian diaduk agar campuran melarut. • Sedangkan pada bak plastik untuk destaining diisi 1000 ml aquades steril. • Masukkan gel yang telah dielektroforesis pada bak staining lalu dibiarkan gel
terendam selama 30 menit.
• Setelah distaining selama 30 menit gel dipindahkan ke dalam bak destaining dan dibiarkan terendan selama 20 menit.
• Kemudian gel diangkan dari bak destaining menggunakan sendok lalu diletakkan di atas kaca UV transiluminator.
• Diatur posisi gel tepat ditengah untuk menghasilkan cahaya yang merata dan memudahkan pengambilan gambar.
• UV transiluminator dinyalakan, gambar dapat diambil menggunakan kamera digital atau kamera polaroid.
Lampiran 4. Prosedur baku analisis SSR kelapa sawit
A. Persiapan bahan PCR
Menghitung konsentrasi DNA total
• Konsentrasi DNA total diestimasi berdasarkan hasil pembacaan alat spectrophotometer UV.
• Sebanyak 100 µl larutan DNA stok diencerkan dengan aquades menjadi 6 ml (pengenceran 60x). Bila volume akhir DNA hasil pengenceran pada cuvet = 3000 ml, maka dengan pengenceran 60x diperlukan 50 µl DNA stok untuk dilarutkan pada 2950 µl aquades steril.
• Blanko disiapkan pada volume yang sama dengan menggunakan aquades. Absorban (A) diukur pada panjang gelombang (λ) 260 dan 280 nm.
• Kemurnian DNA ditetapkan berdasarkan nilai perbandingan A pada λ260 dengan λ280. Bila pembacaan absorbansi = 1 berarti konsentrasi DNA adalah 50 µg/ml dan dianggap sebagai faktor konversi, maka konsentrasi DNA (µg/ml) dalam stok diperoleh dari hasil perkalian faktor konversi, faktor pengenceran dan nilai A pada λ260 nm.
• Tingkat kemurnian yang baik dicapai bila nilai tersebut terletak pada kisaran 1.8-2.0 (Sambrook et al., 1989).
• Rumus yang digunakan adalah : [DNA] = FK x FP x OD260
[DNA] : konsentrasi DNA (µg/ml). FK : factor konversi
FP : factor pengenceran
• Untuk membuat aliquot dengan konsentrasi 25 ng/ µl dengan volume akhir 100 µl maka jumlah DNA stok yang diiperlukan dapat dihitung dengan menggunakan rumus :
DNAs = [DNAa] X volume akhir aliquot OD260
DNAs : Volume DNA stok (µl) yang diperlukan
[DNAa] : Konsentrasi DNA aliquot per µl yang diinginkan
OD260 : Nilai OD260 DNA stok hasil pembacaan spektrofotometer UV
Bila jumlah DNA untuk PCR-SSR ditetapkan sebanyak 25ng per µl maka DNA stok yang dibutuhkan adalah : DNAs = 2500/OD260
Pengenceran Primer Bahan kimia :
• Pasangan primer SSR, Operon • Air bebas ion (ddH2O)
• Pecahan es atau es yang telah diserut
Alat :
• Microcentrifuge
• Deepfreezer
Prosedur :
• Pasangan primer SSR desalted terdiri atas dua buah primer yaitu primer forward dan primer reverse.
• Sebelum diencerkan primer terlebih dahulu disentrifusi pada mode short spin
sebanyak 3 kali untuk mengendapkan primer.
• Persiapkan tray berisi pecahan es atau es yang telah diserut sebagai wadah primer untuk menjaga agar suhu tetap dingin.
• Selanjutnya ditambahkan air bebas ion (ddH2O) atau buffer TE sesuai petunjuk teknis dari katalog terlampir. Untuk pengenceran, bahan pengencer dapat digunakan air bebas ion (ddH2O) atau buffer TE. Dalam penelitian ini bahan pengencer yang digunakan adalah air bebas ion (ddH2O).
Sebagai contoh Primer SSR 001 forward dengan kuantitas 5379 pmol agar konsentrasi akhir menjadi 100 µM maka, ddH2O yang harus ditambahkan adalah 537,9 µl. Primer yang sudah diencerkan ini merupakan primer stok. • Untuk membuat primer sebagai larutan kerja, dengan konsentrasi akhir 10 µM
maka primer stok diencerkan kembali sebesar 10x. Untuk tiap 1 µl primer stok ditambahkan 9 µl ddH2O.
Master mix PCR-SSR 1 reaksi (25 µl) dan 25 reaksi (625 µl ) Bahan kimia :
• Go taq-green, cat No. • DNA kerja
• Primer SSR • Nuclease
• Pecahan es atau es yang telah diserut
Alat :
• Microcentrifuge
• Deepfreezer
Prosedur :
• Persiapkan tray berisi pecahan es atau es yang telah diserut sebagai wadah master mix, primer dan DNA untuk menjaga agar suhu tetap dingin.
• Komposisi master mix 25 reaksi dengan volume 625 µl sebagai berikut. Komposisi Kuantitas 1X (µl) Kuantitas 25X (µl) Go taq-green master mix : 12,5 312,5
Nuclease-free water : 9,5 237,5
Untuk primer dan DNA bukan merupakan komponen master mix, kecuali : Bila kita ingin menganalisis DNA dari satu primer yang sama, maka primer dapat dimasukkan sebagai komponen dari master mix.
Bila kita ingin menganalisis primer dari satu DNA yang sama, maka DNA dapat dimasukkan sebagai komponen dari master mix.
Komposisi Kuantitas 1X (µl) Kuantitas 25X (µl) Forward primer : 1 25
Reverse primer : 1 25
DNA template : 1 25
• Selanjutnya master mix didistribusikan ke 25 mikro tube PCR 200 µl lalu diikuti dengan pendistribusian komponen yang bukan master mix ke tiap tube PCR. Sebelum dilakukan PCR bahan disimpan di freezer suhu -200C.
B. Prosedur PCR – SSR kelapa sawit