METODE PENELITIAN
3.4. Prosedur Kerja
3.4.Prosedur Kerja
3.4.1. Pembuatan Lembar Cangkang Kapsul Simulasi Menggunakan Gelatin Sapi dan Gelatin Babi (Widyaninggar et. al., 2012)
Tabel 3.2. Formulasi Lembar Cangkang Kapsul Keras
Bahan Jumlah
Gelatin 30%
Sorbitol 5%
Pewarna 0.05%
Aquadest Ad 100%
Sebanyak 9 gram gelatin sapi ditimbang dan dibasahi dengan 9 ml air panas sambil diaduk perlahan sampai homogen. Kemudian sebanyak 1.5 gram sorbitol dan 0.0015 gram pewarna ditambahkan, lalu dicukupkan sampai 30 ml aquadest. Larutan dipanaskan dan diaduk sampai semua gelatin larut dan larutan menjadi jernih. Larutan tersebut kemudian dituang ke cetakan menjadi sebuah lapisan tipis. Campuran diletakkan di dalam desikator untuk menjaga kelembabannya. Pembuatan cangkang kapsul dari gelatin babi sama dengan perlakuan seperti diatas.
3.4.2. Pengumpulan Sampel
Pengumpulan sampel dilakukan secara acak dengan mendata produk vitamin yang mengandung vitamin A yang berbentuk cangkang kapsul keras yang beredar di Indonesia berdasarkan ISO 2013/2014. Diperoleh sebanyak 14 produsen produk vitamin yang mengandung vitamin A yang berbentuk cangkang kapsul keras. Kemudian lima produk vitamin yang berasal dari produsen yang berbeda diambil secara acak. Pengambilan sampel ini dilakukan pada tanggal 08-20 April 2015. Masing-masing sampel diberi identitas seperti yang terlihat dalam tabel 3.3.
Tabel 3.3. Identitas Sampel yang berasal dari Produsen yang Berbeda
No. Sampel Identitas
1 Produsen E A
2 Produsen I B
3 Produsen N C
4 Produsen Ei D
5 Produsen V E
3.4.3. Identifikasi Gelatin pada Cangkang Kapsul Keras Sampel (Anonim, 2013)
Larutan uji yang digunakan untuk uji identifikasi gelatin terdiri atas larutan gelatin sebagai kontrol positif; air, larutan koloid HPMC, dan larutan koloid natrium alginat sebagai kontrol negatif; dan larutan cangkang kapsul sampel. Larutan gelatin dan larutan cangkang kapsul sampel disiapkan dengan cara meleburkan gelatin dan cangkang kapsul tersebut pada air hangat. Larutan koloid HPMC disiapkan dengan cara melarutkan 0.1 gram serbuk HPMC dalam 10 ml aquadest panas (90oC). Sedangkan larutan koloid natrium alginat disiapkan dengan cara melarutkan 0.1 gram serbuk natrium alginat dalam 10 ml aquadest.
Proses identifikasi dilakukan dengan cara mengambil sebanyak 2 ml masing-masing larutan uji, lalu menambahkannya dengan 0.05 ml larutan CuSO4 0.7 M dan dihomogenkan. Kemudian sebanyak 0.5 ml larutan NaOH 2 M ditambahkan kedalamnya. Jika timbul warna violet, artinya sampel mengandung gelatin.
3.4.4. Isolasi dan Purifikasi DNA Kontol dan Sampel
a. Preparasi Daging Sapi dan Daging Babi (Rochea, 2008; Erwanto et.al., 2012)
Sebanyak 50 mg daging sapi dan daging babi segar dicincang halus dengan pisau steril. Masing-masing daging tersebut dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifugasi. Kemudian ke dalam tube tersebut ditambahkan 200 µl Tissue
33
Lysis Buffer dan 40 µl larutan Proteinase K. Campuran tersebut divortex selama 1 menit dan diinkubasi pada suhu 57oC selama 21 jam dalam waterbath. Selanjutnya larutan preparasi tersebut siap untuk proses ekstraksi dan isolasi DNA.
b. Preparasi Gelatin, Simulasi Cangkang Kapsul, dan Sampel (Rochea, 2008; Izzah dengan modifikasi, 2014)
Sebanyak 100 mg gelatin sapi dan gelatin babi, cangkang kapsul simulasi sapi dan simulasi babi, serta cangkang kapsul sampel kosong ditimbang dan ditambahkan air hangat sebanyak 200 µl dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifugasi. Kemudian ke dalam tube tersebut ditambahkan 250 µl Tissue Lysis Buffer dan 50µl larutan Proteinase K. Masing-masing campuran tersebut divortex selama 1 menit dan diinkubasi pada suhu 57oC selama 21 jam dalam waterbath. Selanjutnya khusus pada larutan sampel, dilakukan sentrifugasi 10.000 rpm selama 30 menit karena terbentuk endapan putih. Selanjutnya larutan preparasi tersebut siap untuk proses ekstraksi dan isolasi DNA.
c. Isolasi DNA (Rochea, 2008; Izzah dengan modifikasi, 2014) Larutan preparasi daging, gelatin, kapsul simulasi , dan kapsul sampel yang didapatkan kemudian ditambahkan sebanyak 200 µl untuk larutan preparasi daging dan sebanyak 230 µl larutan Binding Buffer. Campuran tersebut divortex segera selama 20 detik dan diinkubasi pada suhu 70oC selama 10 menit dalam waterbath. Kemudian ke dalam tube tersebut ditambahkan 150 µl isopropanol dan dihomogenkan dengan vortex selama 20 detik. Campuran dipipet dan dimasukkan ke dalam Filter Tube yang telah dipasangkan Collecting Tube. Kemudian tube ditutup dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.
Filter Tube dilepaskan dari Collection Tube dan cairan yang melewati filter dibuang bersama dengan Collection Tube.
Filter Tube dipasangkan kembali dengan Collection Tube yang baru. Kemudian 500 µl Inhibitor Removal Buffer ditambahkan melalui penyangga atas Filter Tube dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Filter Tube
dipasangkan kembali dengan Collection Tube yang baru. Kemudian 500µl Washing Buffer ditambahkan dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000rpm selama 1 menit. Pencucian dengan Washing Buffer dilakukan 2 kali. Selanjutnya, Filter Tube dilepaskan dari Collection Tube dan cairan yang melewati filter dibuang. Filter Tube dipasangkan kembali dengan Collection Tube dan disentrifugasi kembali selama 10 detik dengan kecepatan 12000 rpm agar semua
Washing Buffer terbuang dengan sempurna.
Setelah disentrifugasi, Collection Tube dipisahkan dengan
Filter Tube dan dibuang. Kemudian Filter Tube dipasangkan dengan tabung mikrosentrifugasi steril. Ke dalam filter yang berisi DNA daging sapi, daging babi, gelatin sapi, gelatin babi, kapsul simulasi, dan kapsul sampel, masing-masing ditambahkan 150 µl Elution Buffer hangat (70oC). Filter Tube
dan tabung mikrosentrifugasi yang telah ditambahkan Elution Buffer disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Filter Tube dilepaskan dari tabung sentrifugasi yang telah berisi isolat DNA. Tabung mikrosentrifugasi tersebut disimpan pada suhu 4 oC untuk dianalisis selanjutnya.
3.4.5. Pemeriksaan Kadar dan Kemurnian Isolat DNA Menggunakan Spektrofotometer UV (Biodropb, 2012)
Alat dinyalakan dan panel Nucleid Acid dipilih untuk menentukan konsentrasi dan kemurnian DNA. Sample port dibersihkan dengan tisu steril. Sebanyak 2 µl Elution Buffer dituangkan di atas sample port dan dianalisis sebagai blanko. Sample port kembali dibersihkan menggunakan tisu steril. Identitas sampel dimasukkan pada kolom
35
dituangkan di atas sample port secara bergantian. Kemudian tombol
Measure ditekan. DNA dianalisis pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Hasil instrumentasi yang akan didapat adalah data konsentrasi DNA dengan satuan ng/µl dan data kemurnian DNA dengan perbandingan rasio A260 dan A280.
3.4.6. Pemeriksaan Spesifisitas Primer dan Probe (NCBI)
Uji spesifisitas primer dan probe dilakukan dengan melakukan BLAST melalui database NCBI. Pada halaman “BLAST”, dipilih
menu “Nucleid Acid”. Kemudian pada kolom “Enter Query Sequence” dimasukkan urutan basa primer yang akan diuji. Tombol “BLAST”
diklik. Data hasil pengujian yang didapat berupa daftar spesies yang memiliki kemiripan 99-100% dengan urutan basa primer yang diuji. 3.4.7. Amplifikasi DNA Menggunakan Real-Time PCR (Rocheb, 2005;
Rochec; Izzah dengan modifikasi, 2014)
Larutan primer dan probe disiapkan dengan konsentrasi 10 µM dari larutan induk dengan konsentrasi 100 µM dan disimpan dalam sebuah
tube. Selanjutnya dalam tube berukuran 1,5 ml, sebanyak 15 µl PCR
Mix disiapkan dengan cara mencampurkan larutan yang terdiri atas: 1,4 µl aquabidest; 1,6 µl primer forward 10µM; 1,6 µl primer reverse
10 µM; 0,4 µl probe 10 µM; dan 10 µl LightCycler® 480 Probe Master (enzim Taq DNA Polymerase, dNTP mix, dapar, dan 6.4 mM MgCl2). Campuran dihomogenkan menggunakan micropipette dengan cara up and down. Kemudian, sebanyak 5 µl isolat DNA yang akan diuji dipipet ke dalam multiwell plate pada well yang diinginkan dan ditambahkan sebanyak 15 µl PCR Mix yang telah dibuat. Multiwell plate yang berisi campuran DNA yang akan diuji dan PCR Mix
tersebut ditutup dengan sealing foil yang akan mengeliminasi penguapan pada suhu tinggi, kemudian diletakkan pada alat Real-Time
PCR. Semua proses pencampuran sampai pemipetan ke dalam
multiwall plate dilakukan pada tempat yang gelap. Tahap tersebut dilakukan untuk masing-masing DNA daging babi, daging sapi, gelatin
sapi, gelatin babi, kapsul simulasi, dan kapsul sampel yang akan diamplifikasi.
Program LightCycler® 480 Real-Time PCR yang akan digunakan untuk mengamplifikasi DNA diatur dengan pengaturan seperti yang tertera dalam tabel 3.4.
Tabel 3.4. Pengaturan Program Amplifikasi pada LightCycler® 480
Real-Time PCR
Jumlah Siklus Suhu (oC) Waktu
Pre Incubation 1 95 10 menit
Amplification 65 95 10 detik
60 1 menit
72 1 detik
Cooling 1 40 10 detik
3.4.8. Analisis Data
Analisis kandungan babi dan kandungan sapi pada cangkang kapsul keras yang mengandung vitamin A dilakukan dengan melihat hasil amplifikasi DNA pada Real-Time PCR. Jika DNA pada sampel tertentu dengan primer babi dapat teramplifikasi, maka dapat disimpulkan bahwa gelatin pada cangkang kapsul keras tersebut berasal dari babi. Begitu juga sebaliknya, jika DNA pada sampel tertentu dengan primer sapi dapat teramplifikasi, maka dapat disimpulkan bahwa gelatin pada cangkang kapsul keras tersebut berasal dari sapi.
Kurva amplifikasi dihasilkan dengan memplotkan jumlah siklus secara horizontal dan nilai flouresen secara vertikal. Kurva ini dihasilkan secara otomatis oleh RT-PCR. Dari kurva tersebut, kemudian dilihat nilai Cp (Crossing Point) dari setiap isolat DNA yang diuji. Adanya nilai Cp menunjukkan bahwa isolat DNA tersebut dapat
37
teramplifikasi. Cp adalah fraksi jumlah siklus dimana tingkat amplifikasi yang tercermin dari adanya flouresensi mencapai threshold
(ambang). Tingkat ambang flouresensi diatur pada posisi yang sama untuk semua reaksi yang sedang diamati (Vaerman et. al, 2004).
BAB IV
