BAB 3. METODE PENELITIAN
3.4 Prosedur Kerja
Penyiapan serbuk dilakukan dilakukan di Laboratorium Penelitian II. Sebanayk 1 kg bulbus bawang putih dikupas kulit luarnya, kemudian dibersihkan dari pengotor-pengotornya. Kupasan bulbus bawang putih yang sudah bersih diiris tipis-tipis kemudian didehidrasi menggunakan freeze dry dengan suhu 100F (-12,20C) dan tekanan 10 Pa. Bawang putih kering hasil freeze dry kemudian dihancurkan. Serbuk yang didapat diayak dengan mesh 30-100. Setelah itu dibuat suspensi dengan dosis yang telah ditentukan (Li dan Ying, 2007).
3.4.2 Penapisan Fitokimia
Seluruh proses penapisan fitokimia dilakukan di Labortorium Kimia Obat.
Identifikasi Alkaloid
Potong-potong 2-4 gr material tumbuhan yang telah bersih masukkan ke dalam mortar, tambahkan kloroform dan pasir bersih secukupnya, kemudian gerus. Tambahkan 10 mL kloroform amoniakal dan diaduk rata. Campuran dipindahkan ke dalam tabung reaksi dengan cara menyaringnya menggunakan kasa. Selanjutnya tambahkan 0,5 ml 1M asam sulfat dan kocok baik-baik, diamkan beberapa saat. Pipet lapisan jernih yang terbentuk ke dalam 2 tabung reaksi kecil. Satu tabung ditambahkan pereaksi Dragendorff dan tabung lainnya perekasi
Mayer (2-3 tetes). Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya endapan jingga dengan pereaksi Dragendorff dan endapan putih dengan pereaksi Mayer, sebagai berikut:
(+) : sedikit keruh (++) : sangat keruh
(+++) : terjadi endapan. (Chairul, 2003)
Identifikasi Saponin (Frothing test)
Pengujian dilakukan dengan memasukkan 0,5 ml filtrate ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan dengan 5 ml aquades. Kocok selama 30 detik. Adanya busa/buih yang menetap mengindikasikan adanya saponin (Evans, 1996)
Identifikasi Steroid
Pada uji dengan menggunakan pereaksi Liebermann-Burchard, steroid menunjukkan warna biru kehijauan sedangkan triterpenoid menunjukkan warna merah, merah muda, atau ungu. Namun pada saat pengujian dilapangan baik secara langsung pada simplisia maupun pada ekstrak terdapat variasi warna yang dihasilkan, tergantung pada cara bagaimana pengujian tersebut dilakukan (Farnsworth, 1966).
Identifikasi Flavonoid
Ekstrak lebih kurang 10 g material dengan etanol 80%, saring dan keringkan di atas penangas air. Kemudian lemaknya dihilangkan dengan pencucian heksan beberapa kali sehingga warna pigmen hilang atau larutan heksan tidak berwarna lagi. Panaskan residu bebas lemak untuk memindahkan sisa heksana. Tambahkan residu dengan 20 ml etanol dan pindahkan masing-masing 10 ml ke dalam 2 tabung reaksi. Setiap tabung reaksi ditambahkan 0,5 ml asam klorida pekat dan dilakukan uji dengan pereaksi Wilstater (Chairul, 2003).
Salah satu tabung reaksi yang telah berisi asam klorida pekat ditambahkan 3-4 butir logam magnesium (Mg). amati perubahan warna yang terjadi dalam 10 menit. Apabila terbentuk warna, diencerkan dengan air secukupnya dan tambahkan 1 ml oktil alcohol.kocok kuat-kuat kemudian diamkan. Amati perubahan warna pada masing0masing pelarut. Apabila terjadi pembentukan atau perubahan warna menunjukkan reaksi positif terhadap flavonoid (Chairul, 2003).
Identifikasi Tannin
Timbang 2 mg serbuk bawang putih, tambahkan aquades 10 ml, kemudian saring. Masukkan 2 ml filtrate ke dalam tabung reaksi, tambahkan 1 ml FeCl3. Adanya endapan biru kehijauan mengindikasikan adanya tannin (Evans, 1996).
Identifikasi Minyak Atsiri
Identifikasi minyak atsiri dilakukan secara kualitatif dengan mencium bau dari serbuk. Adanya bau khas aromatic bawang putih menandakan adanya minyak atsiri (Evans, 1996).
3.4.3 Parameter Spesifik dan Non-spesifik 3.4.3.1Parameter Spesifik
Identitas ekstrak: nama ekstrak (generic, dagang, paten), nama latin tumbuhan (sistematika botani), bagian tumbuhan yang digunakan, dan nama Indonesia tumbuhan. (Depkes RI, 2000)
Organoleptik: bentuk (padat, serbuk kering, kental, cair), warna (kuning, coklat, dll.), bau (aromatik, tidak berbau, dll.), dan rasa (pahit, manis, kelat, dll.) (Depkes RI, 2000)
3.4.3.2 Parameter Non-spesifik
Susut Pengeringan
Ekstrak ditimbang secara seksama sebanyak 1 g sampai 2 g dan dimasukkan ke dalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 1050C selama 30 menit dan telah ditara. Sebelum ditimbang, ekstrak diratakan dalam botol timbang dengan menggoyangkan botol hingga merupakan lapisan setebal lebih kurang 5 mm sampai 10 mm. Jika ekstrak yang diuji berupa ekstrak kental, ratakan dengan batang pengaduk. Kemudian dimasukkan kedalam ruang pengering, buka tutupnya, keringkan pada suhu 1050C hingga bobot tetap. Sebelum setiap pengeringan, biarkan botol dalam keadaan tertutup mendingin dalam desikator hingga suhu kamar. Jika ekstrak sulit kering dan mencair pada pemanasan, ditambahkan 1g silica pengering yang telah ditimbang secara seksama, setelah dikeringkan dan disimpan dalam desikator pada suhu kamar. Campurkan silica tersebut secara rata dengan ekstrak pada saat panas, kemudian keringkan kembali pada suhu penetapan hingga bobot tetap. (Depkes RI, 2000)
Kadar Air
Penentuann kadar air dari ekstrak yang mengandung senyawa menguap menggunakan metode destilasi (azeotrop). Ppelarut yang digunakan adalah pelarut immiscible, dalam penelitian ini digunakan toluene 200 ml. Siapkan rangkaian alat destilasi, masukkan toluene
serta 2 ml aquadest ke dalam labu didih, lalu tambahkan beberapa batu didih di dalamnya. Setelah aquades dan sebagian toluene berpindah ke tabung pengumpul, masukkan 10 mg serbuk bawang putih yang telah ditimbang secara seksama. Setelah tinggi air pada tabung pengumpul tidak berubah, hitung kenaikan air yang terjadi (Depkes RI, 2000).
Kadar Abu
Lebih kurang 2 g sampai 3 g serbuk yang telah ditimbang secara seksama dimasukkan ke dalam krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara, ratakan. Pijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, dinginkan, timbang. Jika cara ini arang tidak dapat dihilangkan, tambahkan air panas lalu saring melalui kertas saring bebas abu. Pijarkan sisa kertas saring dalam krus yang sama. Masukkan filtrate ke dalam krus, uapkan, pijarkan hingga bobot tetap, timbang. Hitung kadar abu terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara. (Depkes RI, 2000)
3.4.4 Penyiapan Hewan Uji
Hewan Uji yang di gunakan adalah tikus putih jantan galur Sprague Dawley berumur 7-8 minggu dengan berat badan 200-350 gram diaklimatisasi selama dua minggu agar dapat menyesuaikan dengan lingkungannya. Selama proses adaptasi, dilakukan pengamatan kondisi umum dan penimbangan berat badan.
3.4.5 Terminasi dan Pengukuran Parameter
Seluruh kelompok sampel tikus jantan putih galur Sprague Dawley diterminasi pada hari ke-30 dengan cara dimasukkan ke dalam toples yang telah dijenuhkan dengan uap eter, kemudian dibedah untuk diambil testis kanan dan kiri dan kauda epididimis. Masing-masing testis kanan dan kiri ditimbang kemudian disimpan dalam lemari pendingin hingga saat dilakukannya pengujian.
3.4.5.1 Uji Motilitas Sperma
Pengambilan spermatozoa pada epididimis kauda dengan metode cacah dan menggunakan pengenceran dengan garam fisiologis sebesar 1 ml. Untuk
pengamatan motilitas spermatozoa dapat dilakukan dengan mengamati spermatozoa yang telah ditetesi ke bilik hitung Neubauer dengan perbesaran 400 kali. Motilitas sperma ditentukan dari 100 spermatozoa dalam satu lapang pandang. Motilitas spermatozoa dinilai berdasarkan persen spermatozoa dengan motilitas baik, yaitu spermatozoa yang bergerak lurus ke depan, cepat, lincah dan aktif (Kaspul, 2004).
3.4.5.2 Analisis Protein Kaspase-3 dengan Kit ELISA Pembuatan Homogenat
Siapkan potongan 50 mg jaringan testis masing-masing diambil dari testis kanan dan testis kiri tikus, kemudian dimasukkan ke dalam satu tube. Tambahkan Phosphate Buffer Saline (PBS) dengan pH 7 sebanyak 1 mL lalu homogenasi. segera lakukan pengujian atau simpan dalam lemari pendingin pada suhu 40C sampai siap digunakan.
Pembuatan Standar
Sentrifugasi vial standar pada 6000-10000 rpm selama 30 detik. Rekonstitusi standar dengan 1 mL sampel diluen, pastikan tercampur dengan baik. Pipet 250 µl sampel diluen ke dalam masing-masing tube S0-S6. Buat seri pengenceran dengan menambahkan 250 µl larutan standard yang telah direkonstitusi ke dalam tube S6 yang telah berisi diluen, homogenkan. Lakukan pengenceran dari tube S6 ke tube selanjutnya hingga tube S1. Tube S0 berisi sampel diluen tanpa standard yang bertindak sebagai blanko.
Analisis Protein Kaspase-3
Siapkan reagen, sampel dan standar. Sampel homogenate yang telah dibuat dimasukkan ke dalam mikroplate sebanyak 100 µL. Inkubasi dalam oven selama 2 jam dengan suhu 370C. Setelah inkubasi, buang cairan dalam well (tanpa pencucian). Selanjutnya, tambahkan 100 µL biotin anti bodi ke dalam setiap well. Tutup well menggunakan strip perekat kemudian inkubasi selama 1 jam pada suhu 370C. Lakukan pencucian menggunakan wash buffer hingga 3x pengulangan.
Pada pencucian terakhir, hilangkan semua wash buffer yang tersisa dengan dekantasi. Letakkan tube secara terbalik diatas tissue bersih.
Tambahkan 100 µL HRP-avidin ke dalam setiap well. Tutup mikroplate menggunakan strip perekat baru, lalu inkubasi selama 1 jam pada suhu 370C. Lakukan pencucian seperti pada langkah sebelumnya, lakukan hingga 5x pengulangan. Setelah pencucian terakhir, tambahkan 50 µL TMB substrat ke dalam setiap well, inkubasi selama 15-30 menit dan pastikan terlindung dari cahaya. Selanjutnya, tambahkan 50 µ L Stop solution ke dalam setiap well, ketuk-ketuk tube perlahan untuk memastikan tercampur dengan baik. Tahap terakhir adalah menentukan optical density setiap well dengan menggunakan ELISA reader yang diatur pada panjang gelombang 450 nm.