Selection by progeny test
A. Prosedur baku pembuatan larutan kimia untuk ekstraksi DNA CTAB 5% (b/v) (Larutan stok, 100 ml) (Rogers dan Bendich 1998)
Bahan kimia :
• CTAB (N-cetyl, N-trimethyl-ammoniumbromide), MERCK, cat. No. 1.02342.0100.
• NaCl (Natrium Chloride), MERCK cat. No. 1.06404.1000. • Aquades steril
Alat :
• Magnetik stirrer
• Hot plate stirrer
Prosedur :
• Sebanyak 5,00 g CTAB dan 2,05 g NaCl dimasukkan ke dalam beaker glass
250 ml.
• Ditambahkan 100 ml Aquades steril lalu diletakkan pada hot plate stirrer. • Pelarutan dilakukan dengan menggunakan magnetic stirrer pada hot plate
stirrer.
• Setelah bahan-bahan benar-benar melarut, larutan dimasukkan pada botol kaca bening 100 ml tertutup, lalu disimpan pada suhu ruang.
NaCl 5 M (larutan stok, 100 ml) (Sambrook et al. 1989)
Bahan kimia :
• NaCl (Natrium Chloride), MERCK cat. No. 1.06404.1000. • Aquades steril
Alat :
• Magnetik stirrer
Prosedur :
• Disiapkan 65 ml aquades steril kemudian ditimbang sebanyak 29,22 g NaCl. • Secara bertahap dilarutkan NaCl dengan aquades ke dalam beaker glass 250 ml
menggunakan magnetic stirrer pada hot plate stirrer.
• Pelarutan dilakukan sedikit demi sedikit karena NaCl pekat sukar larut dalam air.
• Setelah seluruh bahan-bahan benar-benar melarut, volume larutan ditepatkan 100 ml dengan menambahkan aquades steril.
• Larutan dimasukkan pada botol kaca bening 100 ml tertutup, lalu disimpan pada suhu ruang.
EDTA 0,5 M pH 8,0 (larutan stok, 100 ml) (Sambrook et al. 1989)
Bahan kimia :
• Na-EDTA (Tritriplex III), MERCK cat. No. 1.08418.0250. • NaOH (Natrium Hydroxide), MERCK cat. No. 1.06498.0500. • Aquades steril
• Kertas Lakmus
Alat :
• Magnetik stirrer
• Hot plate stirrer
• pH meter
Prosedur :
• Sebanyak 18,6 g Na-EDTA dan 2,0 g NaOH dimasukkan ke dalam beaker glass 250 ml.
• Bahan dilarutkan dengan menambahkan 80 ml aquades steril, kemudian pelarutan dilakukan dengan menggunakan magnetic stirrer pada hot plate stirrer.
• Setelah seluruh bahan melarut pengecekan pH dilakukan dengan mencelupkan kertas lakmus atau pH meter pada larutan.
• Pengaturan pH 8,0 dilakukan dengan menambahkan NaOH 2,5 M setetes demi setetes pada larutan hingga pH yang dikehendaki tercapai.
• Volume larutan ditepatkan 100 ml dengan menambahkan aquades steril. • Larutan dimasukkan pada botol kaca bening 100 ml tertutup, lalu disimpan
pada suhu ruang.
Tris-HCl 1 M pH 8,0 (larutan stok, 100 ml) (Sambrook et al. 1989)
Bahan kimia :
• Trizma base, SIGMA cat. No. T-1503. • HCl p.a
• Aquades steril • Kertas Lakmus
Alat :
• Magnetik stirrer
• Hot plate stirrer
• pH meter
Prosedur :
• Sebanyak 12,11 g Trizma base dan 4,2 ml HCl dimasukkan ke dalam beaker glass 250 ml.
• Bahan dilarutkan dengan menambahkan 80 ml aquades steril, kemudian pelarutan dilakukan dengan menggunakan magnetic stirrer pada hot plate stirrer.
• Setelah seluruh bahan melarut pengecekan pH dilakukan dengan mencelupkan kertas lakmus atau pH meter pada larutan.
• Pengaturan pH 8,0 dilakukan dengan menambahkan HCl pekat setetes demi setetes pada larutan hingga pH yang dikehendaki tercapai.
• Volume larutan ditepatkan 100 ml dengan menambahkan aquades steril. • Larutan dimasukkan pada botol kaca bening 100 ml tertutup, lalu disimpan
Tris-HCl 1 M pH 7,4 (larutan stok, 50 ml) (Sambrook et al. 1989)
Bahan kimia :
• Trizma base, SIGMA cat. No. T-1503. • HCl p.a
• Aquades steril • Kertas Lakmus
Alat :
• Magnetik stirrer
• Hot plate stirrer
• pH meter
Prosedur :
• Sebanyak 6,055 g Trizma base dan 3,5 ml HCl dimasukkan ke dalam beaker glass 100 ml.
• Bahan dilarutkan dengan menambahkan 40 ml aquades steril, kemudian pelarutan dilakukan dengan menggunakan magnetic stirrer pada hot plate stirrer.
• Setelah seluruh bahan melarut pengecekan pH dilakukan dengan mencelupkan kertas lakmus atau pH meter pada larutan.
• Pengaturan pH 7,4 dilakukan dengan menambahkan HCl pekat setetes demi setetes pada larutan hingga pH yang dikehendaki tercapai.
• Volume larutan ditepatkan 50 ml dengan menambahkan aquades steril.
• Larutan dimasukkan pada botol kaca bening 50 ml tertutup, lalu disimpan pada suhu ruang.
Na-Asetat 3 M pH 5,2 (larutan stok, 100 ml) (Sambrook et al. 1989)
Bahan kimia :
• Na-Asetat.3H2O, MERCK, cat. No. 1.06268.0250. • Acetic acid glacial, MERCK, cat. No. 1.00063.2500. • Aquades steril
Alat :
• Magnetik stirrer
• Hot plate stirrer
• pH meter
Prosedur :
• Sebanyak 40,81 g Na-Asetat.3H2O dimasukkan ke dalam beaker glass 250 ml. • Bahan dilarutkan dengan menambahkan 55 ml aquades steril, kemudian
pelarutan dilakukan dengan menggunakan magnetic stirrer pada hot plate stirrer.
• Setelah seluruh bahan melarut pengecekan pH dilakukan dengan mencelupkan kertas lakmus atau pH meter pada larutan.
• Pengaturan pH 5,2 dilakukan dengan menambahkan acetic acid glacial setetes demi setetes pada larutan hingga pH yang dikehendaki tercapai.
• Volume larutan ditepatkan 100 ml dengan menambahkan aquades steril. • Larutan dimasukkan pada botol kaca bening 100 ml tertutup, lalu disimpan
pada suhu ruang.
TE (Tris-EDTA) Buffer 50X (larutan stok, 50 ml) (Sambrook et al. 1989)
Bahan kimia :
• Larutan stok Tris-HCl 1 M pH 8,0 • Larutan stok EDTA 0,5 M pH 8,0 • Aquades steril
• Kertas saring kualitatif
Alat :
• Magnetik stirrer
• Hot plate stirrer
Prosedur :
• Sebanyak 25 ml larutan stok Tris-HCl 1 M pH 8,0 dan 5 ml larutan stok EDTA 0,5 M pH 8,0 dimasukkan ke dalam beaker glass 100 ml.
• Bahan dilarutkan dengan menambahkan 20 ml aquades steril, kemudian pelarutan dilakukan dengan menggunakan magnetic stirrer pada hot plate stirrer.
• Setelah seluruh bahan melarut, larutan disaring menggunakan kertas saring kualitatif.
• Larutan dimasukkan pada botol kaca bening 50 ml tertutup, lalu disimpan pada suhu ruang.
Buffer ekstraksi-CTAB (larutan kerja, 250 ml) (Rogers dan Bendich 1998)
Bahan kimia :
• Larutan stok CTAB 5% • Larutan stok NaCl 5 M
• Larutan stok Tris-HCl 1 M pH 8,0 • Larutan stok EDTA 0,5 M pH 8,0 • Aquades steril.
Alat :
• Magnetik stirrer
• Hot plate stirrer
Prosedur :
• Sebanyak 100 ml larutan stok CTAB 5%, 63 ml larutan stok NaCl 5 M, 25 ml larutan stok Tris-HCl 1 M pH 8,0 dan 10 ml larutan stok EDTA 0,5 M pH 8,0 dimasukkan ke dalam beaker glass 500 ml.
• Bahan dilarutkan dengan menambahkan 52 ml aquades steril, kemudian pencampuran dilakukan dengan menggunakan magnetic stirrer pada hot plate stirrer.
• Setelah seluruh bahan melarut, larutan dimasukkan pada botol kaca bening 250 ml tertutup, lalu disimpan pada suhu ruang.
KIAA 24:1 (larutan kerja, 100 ml) (Sambrook et al. 1989)
Bahan kimia :
• Chloroform, MERCK, cat. No. 1.02445.2500. • Isoamilalkohol, MERCK, cat. No. 1.00979.1000. • Aquades steril.
Prosedur :
• Sebanyak 96 ml Chloroform dan 4 ml isoamilalkohol dimasukkan ke dalam botol kaca bening 100 ml tertutup.
• Pencampuran dilakukan dengan mengguncang botol, lalu disimpan pada suhu ruang.
Isopropanol dingin (larutan kerja, 100 ml) Bahan kimia :
• Isopropanol, 2-propanol, MERCK, cat. No. 1.09634.2500.
Prosedur :
• Sebanyak 100 ml isopropanol dimasukkan ke dalam botol kaca bening 100 ml tertutup.
• Lalu disimpan di dalam lemari pendingin suhu 40C.
Ethanol absolut (larutan kerja, 100 ml) Bahan kimia :
• Ethanol p.a., MERCK, cat. No. 1.00983.2500.
Prosedur :
• Sebanyak 100 ml ethanol dimasukkan ke dalam botol kaca bening 100 ml tertutup. Lalu disimpan di dalam lemari pendingin suhu 40C.
Ethanol 70% (larutan kerja, 100 ml)
Bahan kimia :
• Ethanol p.a., MERCK, cat. No. 1.00983.2500. • Aquades steril.
Prosedur :
• Sebanyak 70 ml Chloroform dan 30 ml aquades steril dimasukkan ke dalam botol kaca bening 100 ml tertutup.
• Pencampuran dilakukan dengan mengguncang botol, lalu disimpan di dalam lemari pendingin suhu 40C.
RNAase-A (larutan stok, 10 mg/ml)
Bahan kimia :
• RNAase-A, SIGMA cat. No. R-5125 • Larutan stok Na-Asetat 3 M pH 5,2 • Larutan stok Tris-HCl 1 M pH 7,4 • Aquades steril.
Alat :
• Waterbath
Prosedur :
• Sebanyak 10 mg RNAase-A, 3,3 µl larutan stok Na-Asetat 3 M pH 5,2 dan 996,7 µl aquades dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 ml.
• Pencampuran dilakukan dengan spin manual.
• Suspensi yang terbentuk diinkubasi di dalam waterbath pada suhu 1000C selama 15 menit untuk menghilangkan DNAase yang masih terdapat pada RNAase.
• Suspensi dibiarkan dingin pada suhu ruang, kemudian ditambahkan 100 µl larutan stok Tris-HCl 1 M pH 7,4 (0,1 volume).
• Untuk satu stok sampel DNA (volume 500 µl) aplikasi larutan RNAase-A diberikan sebanyak 5,5 µl.
• Apabila larutan RNAase-A digunakan untuk jangka panjang sebaiknya dibuatkan aliquot-nya.
TE Buffer 1X (larutan kerja, 100 ml)
Bahan kimia :
• Larutan stok TE buffer 50X. • Aquades steril.
Prosedur :
• Sebanyak 2 ml larutan stok TE buffer 50X dan 98 ml aquades steril dimasukkan ke dalam botol kaca bening 100 ml tertutup.
• Pencampuran dilakukan dengan mengguncang botol, lalu disimpan pada suhu ruang.
