BAHAN DAN METODE PENELITIAN
3.3 Prosedur penelitian
3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah daun benalu alpukat (Dendrophthoe pentandra (L).(Miq) yang diperoleh dari daerah Desa Jandi Kecamatan Tiga Binanga Kabupaten Karo. Daun benalu alpukat (Dendrophthoe pentandra (L).(Miq) dipisahkan dari batangnya. Kemudian daun benalu alpukat (Dendrophthoe pentandra (L).(Miq) dicuci bersih, dan dikeringkan dalam ruangan selama 6 hari, dihaluskan dengan blender sehingga dihasilkan serbuk daun benalu alpukat (Dendrophthoe pentandra (L).(Miq) sebanyak 250 g
3.3.2 Pembuatan Ekstrak Metanol, Etil Aseatat dan n-Heksana Dari Daun benalu alpukat (Dendrophthoe pentandra (L).Miq)
Serbuk daun benalu alpukat (Dendrophthoe pentandra (L).(Miq) ditimbang sebanyak 250 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 4 L sampai sampel terendam dan dibiarkan selama 24 jam. Maserat disaring dan diperoleh ekstrak metanol benalu alpukat. Ekstrak metanol benalu alpukat dipekatkan diatas penangas air sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Ekstrak pekat metanol yang diperoleh kemudian dilarutkan dengan etil asetat dan disaring sehingga diperoleh filtrat dan residu kemudian residu di keringkan dan diuji aktivitasnya terhadap bakteri S.aureus, S.mutans dan E.coli
Lapisan metanol dan n-heksana dipekatkan kembali dengan penangas air hingga diperoleh ekstrak pekat methanol dan ekstrak pekat n-heksana. Ekstrak pekat methanol dan n-heksana dilanjutkan dengan uji antibakteri terhadap bakteri S.aureus, S.mutans, dan E.coli.
Ekstrak etil asetat dipekatkan dengan menggunakan penangas air sehingga diperoleh ekstrak pekat etil asetat, ekstrak pekat yang diperoleh diuapkan hingga semua etil asetat menguap. Ekstrak pekat tersebut dilarutkan dengan metanol dan dipartisi dengan n-heksana hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan bawah yaitu metanol dan lapisan atas yaitu n-heksana. Partisi dilakukan kembali secara berulang-ulang menggunakan pelarut n-heksana sampai lapisan n-heksaan bening
3.3.3 Skrining Fitokimia Dari Daun Benalu Alpukat
Dipotong kecil-kecil daun benalu alpukat (Dendrophthoe pentandra (L).(Miq) segar sebanyak 50 g kemudian panaskan pada water batch hingga diperoleh ekstraknya, ekstrak yang diperoleh dilakukan uji skrining dengan beberapa tahap uji sebagai berikut:
3.3.4 Uji Fenolik
Ekstrak daun benalu alpukat (Dendrophthoe pentandra (L).Miq) dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan FeCl3 5%, jika terbentuk larutan berwarna hitam maka positif mengandung tanin.
3.3.5 Uji Terpenoida
Ekstrak daun benalu alpukat (Dendrophthoe pentandra (L).Miq) diteteskan pada plate klomatorgrafi lapis tipis ditambahkan CeSO4 1% Kemudian panaskan, jika terbentuk warna merah kecoklatan maka positif mengandung terpenoida.
3.3.6 Uji Alkaloida
Ektrak daun benalu alpukat (Dendrophthoe pentandra (L).Miq) dimasukkan dalam 3 tabung reaksi. Tabung I ditetesi pereaksi Bouchardat, jika terbentuk endapan coklat maka positif mengandung alkaloida. Tabung II ditetesi pereaksi Meyer, jika terbentuk endapan putih, maka positif mengandung alkaloida. Tabung III ditetesi pereaksi Dragendorff, jika terbentuk endapan jingga, maka positf mengandung alkaloida.
3.3.7 Uji Saponin
Ekstrak daun benalu alpukat (Dendrophthoe pentandra (L).Miq) dimasukkan kedalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml aquadest, kemudian dikocok kuat-kuat. Jika terbentuk busa maka positif mengandung saponin.
3.3.8 Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol, Etil Asetat, dan n-Heksana Dari Daun Benalu Alpukat
3.3.8.1 Sterilisasi Alat
Alat yang digunakan dicuci sampai bersih dan dikeringkan lalu ditutup rapat dengan kapas dan kertas perkamen. Kemudian dimasukkan kedalam autoklaf dan ditutup rapat. Kemudian disterilkan selama 15 menit pada suhu 121ºC.
3.3.8.2 Pembuatan Media Nutrient Agar (NA)
Sebanyak 7 g Nutrient Agar dimasukkan dalam erlenmeyer lalu dilarutkan dalam 250 ml aquadest dan dipanaskan hingga semua larut dan mendidih. Lalu disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. Komposisi dari media nutrient agar adalah ekstrak beef, pepton, dan agar.
3.3.8.3 Pembuatan Media Agar Miring dan Stok Kultur Bakteri
Kedalam tabung reaksi yang steril dimasukkan 3 ml media nutrient agar steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai memadat pada posisi miring membentuk sudut 30-45o. Biakan bakteri Staphylococcus aureus dari straim utama diambil dengan jarum ose steril lalu diinokulasi pada permukaan media nutrient agar miring dengan cara menggores, kemudian diinkubasi pada suhu 35oC selama 18-24 jam. Hal yang sama juga dilakukan pada biakan bakteri Streptococcus mutans dan Escherichia coli.
3.3.8.4 Pembuatan Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Sebanyak 19 g serbuk mueller hinton agar dimasukkan dalam erlenmeyer lalu dilarutkan dalam 500 ml aquadest dan dipanaskan hingga semua larut dan mendidih.
Lalu disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. Adapun komposisi dari media mueller hinton agar adalah ekstrak beef, asam hidrolisat kasein, agar dan aquadest.
3.3.8.5 Pembuatan Inokulum Bakteri
Sebanyak 3,25 g nutrient broth dilarutkan dengan 250 ml aquadest dalam erlenmeyer dan dipanaskan hingga semua larut dan mendidih, kemudian disterilkan di autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit dan didinginkan. Lalu koloni bakteri Staphylococcus aureus diambil dari stok kultur menggunakan jarum ose steril kemudian disuspensikan ke dalam 10 ml media nutrient broth steril dalam tabung reaksi dan diinkubasikan pada suhu 35oC selama 3 jam, lalu diukur panjang gelombang dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 580-600 nm. Hal yang sama dilakukan untuk koloni bakteri Streptococcus mutans dan Escherichia coli.
3.3.8.6 Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak Metanol, Etil Asetat, dan n-Heksana Daun Benalu Alpukat
Ekstrak metanol, etil asetat, dan n-heksana dibuat dalam konsentrasi 10%, 20%, 30%dengan menimbang ekstrak masing-masing sebanyak 0,1 g, 0,2 g, 0,3g kemudian dilarutkan kedalam 1 ml DMSO.
3.3.8.7 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol, Etil Asetat, dan n-Heksan Dari Daun Benalu Alpukat
Media MHA sebanyak 15 ml dengan suhu 45-50oC dituang ke dalaam cawan petri, Kemudian dibiarkan sampai memadat. Diambil bakteri dari inokulum bakteri dengan menggunakan cotton bad steril, kemudian di goreskan ke media MHA lalu dimasukkan kertas cakram yang telah dicelupkan dengan ekstrak pekat metanol, etil asetat, dan n-heksana benalu alpukat dengan berbagai variasi konsentrasi kedalam cawan petri yang telah berisi bakteri, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu ± 35oC selama 24 jam. Selanjutnya diukur diameter zona hambat disekitar kertas cakram dengan jangka sorong. Dilakukan perlakuan yang sama terhadap bakteri S.mutans, dan E.coli.dalam inkubator pada suhu ± 35oC selama 24 jam. Hal yang sama dilakukan untuk koloni bakteri Streptococcus mutans dan Escherichia coli.
3.3.9 Bagan Penelitian
3.3.9.2 Uji Skrining Fitokimia
3.3.9.3 Uji Sifat Antibakteri Eksrak Metanol, Etil Asetat, dan n-Heksana Daun Benalu Alpukat
3.3.9.3.1Pembuatan Media Mueller Hinton Agar (MHA)