METODE PENELITIAN
4.6. Prosedur Penelitian In Vitro
4.6.1 Pembuatan Kultur Primer dan Sekunder
Kulit preputium penis yang telah disiapkan sebagai kultur primer dimasukkan ke dalam medium komplit, kemudian disimpan satu hari dalam lemari pendingin dengan suhu 4º C. Keesokan harinya kulit preputium penis tersebut diletakkan pada cawan petri, selanjutnya proses dilakukan dalam laminar
air flow. Kulit tersebut dipotong dengan ukuran kira-kira 3-4 cm, dipisahkan dari
jaringan subkutan dan epidermis. Setelah itu dipotong dengan ukuran sekecil-kecilnya menggunakan gunting jaringan dengan bantuan pinset. Selanjutnya potongan-potongan jaringan tersebut dipindahkan ke dalam 3 buah petri kecil, disusun dibagian tengah petri dan ditutup dengan cara agak ditekan menggunakan
cover glass. Sisa media komplit di sekitarnya dibuang menggunakan pipet mikro,
setelah sisa media komplit tersebut habis, diganti dengan media komplit 20% sebanyak 3 ml pada masing-masing petri, dan dipastikan cover glass yang menutupi potongan jaringan tersebut tidak mengambang dengan menekannya menggunakan ujung tip pipet mikro yang digunakan mengisi larutan media komplit tersebut. Kemudian ketiga petri kecil masing masing ditutup dengan tutup petri, selanjutnya disusun dalam petri besar. Petri besar ditutup dan diberi label. Kultur primer yang ditumbuhkan ini disimpan dalam inkubator CO2 (370C, 5% CO2, kelembaban 95%).
Setelah 24 jam, kultur diamati setiap hari dengan mikroskop inverted, apakah sudah tampak adanya sel fibroblast. Diamati juga kemungkinan terjadinya kontaminasi bakteri atau jamur yang dapat menghambat pertumbuhan sel fibroblast. Apabila terjadi kontaminasi bakteri proses pertumbuhan kultur sel tidak dapat dilanjutkan dan harus segera diganti dengan yang baru. Media komplit 20% pada kultur diganti setiap 3 hari. Sel fibroblast yang tumbuh mempunyai sifat menempel pada dasar petri sedangkan sel yang mati akan mengambang di permukaan media, sehingga saat penggantian media sel yang mati akan ikut terbuang.
Sel fibroblast dari kultur primer yang sudah konfluen 60-70% dapat dipanen dan dibiakkan kembali sebagai sub kultur (kultur sekunder). Supernatan dibuang, sisa larutan FBS yang masih ada dalam petri dibilas menggunakan media RPMI sampai bersih, setelah itu ditambahkan trypsin 0,25% sebanyak 1 ml untuk melepaskan sel yang melekat pada dasar petri, kemudian diinkubasi selama 8 menit. Dengan pemberian trypsin, sel akan berbentuk bulat dan ukurannya menjadi lebih besar. Setelah inkubasi sejumlah sel dapat dibiakkan kembali sebagai sub kultur dengan memindahkan sejumlah sel ke TCF lainnya yang telah diisi media komplit 7 ml, selanjutnya disimpan kembali dalam inkubator CO2 dan media diganti tiap 3 hari. Apabila sel telah cukup banyak jumlahnya dapat dilakukan panen sel dan penghitungan jumlah sel untuk proses perlakuan yang akan diberikan selanjutnya.
4.6.2 Penghitungan Jumlah Sel Uji
Adapun cara penghitungan sel adalah dengan cara sebagai berikut, terlebih dahulu larutan yang tersisa dalam TCF dibuang, setelah suspensi sel telah bersih dari FBS, dipindahkan ke dalam tabung sentrifus 15 ml yang telah diisi media RPMI, disentrifus 1500 rpm selama 10 menit. Tampak sel menjadi berwarna putih mengendap di bagian dasar, supernatan dibuang. Sel yang telah mengendap ditambahkan media komplit 1 ml dan dihomogenkan. Suspensi sel yang telah homogen diambil sebanyak 20µl, dimasukkan ke dalam well plate, kemudian tambahkan tripan blue 180µl lalu dihomogenkan. Ambil sel sebanyak 10µl masukkan ke dalam bilik hitung Neubauer, selanjutnya dihitung jumlah sel fibroblast dengan menggunakan mikroskop binokuler pembesaran 10x. Cara
penghitungannya adalah dengan menghitung seluruh sel fibroblast yang ditemukan dalam 4 buah kotak berukuran 4x4 pada bilik hitung, selanjutnya dilakukan dengan menggunakan perhitungan seperti berikut ini.
n1+n2+n3+n4
Jumlah sel / ml = x 106 : 10 4
n = jumlah sel dalam masing masing bilik hitung 4 = jumlah bilik hitung
106 = konstanta jumlah sel per ml larutan 10 = jumlah pengenceran larutan
4.6.3 Uji Aktivitas In Vitro
Sel fibroblast yang telah siap untuk diberikan perlakuan dibagi menjadi 3 kelompok dan sub kelompok dengan variasi dosis astaxanthin dan penyinaran UVB yaitu :
Kelompok 1 : tanpa perlakuan apapun, sebagai kontrol.
Kelompok 2 : dengan perlakuan pajanan UVB dosis bervariasi 25 mJ/cm², 50 mJ/cm², dan 100 mJ/cm².
Kelompok 3 : dengan variasi dosis pajanan UVB 25 mJ/cm², 50 mJ/cm², dan 100 mJ/cm² yang sebelumnya telah diberikan astaxanthin dengan variasi dosis 3 µM, 5 µM, dan 7 µM.
Untuk memudahkan dalam perlakuan penyinaran UVB, maka sel sel fibroblast ditempatkan pada 4 buah 96-well plate (2x104 sel/well), dimana satu buah well
plate untuk menempatkan kelompok kontrol yang tidak diberikan perlakuan
apapun, dan 3 buah well plate masing masing untuk menempatkan kelompok sel yang diberikan penyinaran 25 mJ/cm2, 50 mJ/cm2 dan 100 mJ/cm2 (dengan astaxanthin dan tanpa astaxanthin). Setelah pemberian astaxanthin sesuai dosis maka semua kelompok sel tersebut diinkubasi terlebih dahulu selama 24 jam sebelum diberikan penyinaran.
Sebelum penyinaran dilakukan media dari semua kelompok yang akan disinari dibilas dengan PBS sebanyak 2 kali, dan selanjutnya media diganti dengan PBS untuk tahap penyinaran. Setelah penyinaran selesai dilakukan sesuai dengan dosis perlakuan pada masing masing well plate, PBS diganti dengan media komplit dan diinkubasi selama 48 jam, dan selanjutnya akan dilakukan pengujian terhadap MMP-1.
4.6.4 Prosedur Pengujian MMP-1
Empat puluh delapan jam setelah perlakuan penyinaran, supernatan dari
masing masing kelompok tersebut dikumpulkan, ekspresi MMP-1 dinilai dengan menggunakan kit MMP-1 human MMP-1enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA) dan dilakukan prosedur sebagai berikut:
1. Semua reagen dan sampel yang akan diukur diletakkan dalam ruangan dengan suhu kamar (18º- 25ºC). Reagen dipersiapkan terlebih dahulu, diencerkan atau dilarutkan sesuai dengan prosedur yang telah ada.
2. Masukkan 100 µl larutan standar dan sampel pada masing masing lubang sumuran. Setelah itu ditutup dengan lembaran penutup lempengan sumuran, dan diinkubasi selama 2,5 jam pada suhu ruangan.
3. Buang semua larutan yang ada dalam lubang sumuran, cuci sebanyak 4 kali dengan larutan buffer pencuci sampai tak ada yang tersisa.
4. Selanjutnya tambahkan 100 µl pendeteksi antibodi MMP-1(biotinylated antibody) pada masing masing lubang sumuran, dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar dan gentle shaking.
5. Buang semua larutan yang ada pada lubang sumuran seperti pada langkah no 3.
6. Tambahkan 100 µl larutan streptavidine pada tiap lubang sumuran, diinkubasi selama 45 menit pada suhu kamar dengan gentle shaking.
7. Buang semua larutan seperti pada langkah no 3
8. Tambahkan 100 µl TMB one-step substrate pada tiap lubang sumuran, diinkubasi selama 30 menit pada ruang gelap dan suhu kamar dengan
gentle shaking.
9. Tambahkan 50 µl Stop Solution pada tiap lubang sumuran dan segera dilakukan pembacaan dengan ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm