BAHAN DAN METODA
3.3 Prosedur penelitian .1Isolat Virus
Isolat virus berasal dari Dr. Uun Yanuhar-UNIBRAW-Malang. Ikan kerapu positif VNN hasil diagnosis PCR diambil organnya untuk digunakan sebagai bahan suspensi organ 10%. Ekstraksi virus dilakukan dengan metode Malole et al., (2006) yaitu dengan cara menggerus mata dan otak ikan dengan mortar dan ditambahkan larutan NaCI fisiologis, sehingga menghasilkan konsentrat virus 10%. Pada pelaksanaan penggerusan ini, mortar dan larutan NaCl fisiologis dalam kondisi dingin. Hasil gerusan yang telah halus, disentrifugasi pada 3000 rpm selama 15 menit dengan suhu 5°C. Supernatan diambil dengan syringe kemudian disaring dengan kertas saring miliphore 0,45 µm. Hasil saringan merupakan inokulan baku virus VNN dan ditambahkan Penicillin 10.000 IU dan Streptomicyin 10.000 µg. Supernatan diencerkan dengan larutan Hank's Balauced Salt Solution (HBSS). Untuk keperluan selama penelitian bahan inokulan virus ini kemudian diawetkan dalam deep freezer (suhu -40°C).
3.3.2 Uji Fish Infectious Dosis-50 (FID50)
Penelitian diawali dengan uji pendahuluan yaitu mencari nilai FID50 dengan metode Reed and Muench dalam Amrullah (2004) yaitu dengan cara menginfeksikan virus VNN 0,1 ml/ekor ikan kerapu macan dengan konsentrasi 10-2 sampai 10-7 pada masing-masing akuarium. Kemudian akuarium diisi air laut 10 L dan 6 ekor ikan. Gejala klinis penyakit ikan diamati dan dicatat tingkat kesakitan ikan selama 7 hari. Nilai FID50 dihitung dengan menggunakan rumus Reed and Muech. Hasil yang didapatkan kemudian dijadikan sebagai konsentrasi virus yang akan diinfeksikan ke benih ikan kerapu macan pada uji utama.
Rumus Reed and Muench 1938 dalam Amrullah (2004):
>50% - 50% PD =
Keterangan :
P.D = Proportionate Distance
>50% = Prosentase pengamatan di atas mendekati 50% <50% = Prosentase pengamatan di bawah mendekati 50%
3.3.3 Pengaruh pH Terhadap Patogenitas VNN
Uji utama dilakukan untuk mengkaji pengaruh konsentrasi pH media air terhadap tingkat patogenitas virus VNN pada benih kerapu macan. Perlakuan perbedaan konsentrasi pH terdiri dari 6 (enam) perlakuan + 1 (satu) kontrol. Masing-masing akuarium percobaan diisi dengan 10 ekor ikan kerapu macan. Perlakuan diaplikasikan dengan tiga ulangan. Penginfeksian virus positif VNN dilakukan secara intramuscular (Dosis FID50-72 jam). Pengamatan dilakukan selama 6 hari. Adapun rancangan perlakuannya adalah sebagai berikut:
Po = Pemeliharaan kerapu macan negatif VNN (kontrol)
Pi = Pemeliharaan kerapu macan diinfeksi virus (+) VNN FID50 pada pH 6,0 Pii = Pemeliharaan kerapu macan diinfeksi virus (+) VNN FID50 pada pH 6,5 Piii = Pemeliharaan kerapu macan diinfeksi virus (+) VNN FID50 pada pH 7,0 Piv = Pemeliharaan kerapu macan diinfeksi virus (+) VNN FID50 pada pH 7,5 Pv = Pemeliharaan kerapu macan diinfeksi virus (+) VNN FID50 pada pH 8,0 Pvi = Pemeliharaan kerapu macan diinfeksi virus (+) VNN FID50 pada pH 8,5
3.3.4 Pengamatan Gejala Klinis
Pengamatan kesakitan/moribund ikan kerapu macan setelah diinfeksi virus VNN dievaluasi setiap 3 jam sekali berdasarkan gejala klinis khas VNN pada setiap perlakuan secara visual dan dicatat di tabel pengamatan. Ikan mati/sekarat (moribund) yang menunjukkan gejala klinis khas VNN adalah kelesuan, perilaku renang abnormal (gerakan memutar dan menabrak kasar), pembesaran gelembung renang (swim
bladder), perubahan warna tubuh ikan menjadi gelap dan hilangnya selera makan
Hasil pengamatan yang dilakukan pada setiap perlakuan digambarkan secara sistematis dan jumlah ikan mati/sakit karena infeksi virus VNN pada masing-masing perlakuan dihitung dari awal infeksi sampai hari ke 7. Persentase ikan mati/sakit dihitung berdasarkan rumus Reed and Muench dalam Amrullah (2004):
Nt
I = X 100% No
Keterangan : I = Persentase ikan sakit karena terinfeksi VNN (%)
Nt = Jumlah ikan sakit terinfeksi VNN (ekor) No = Jumlah ikan tiap unit percobaan (ekor)
3.3.5 Uji Hematologi
Pemeriksaan hematologi ikan uji (kontrol dan perlakuan) dilakukan dengan metode Benjamin (1978). Pemeriksaan ini dilakukan setelah penginfeksian virus dan timbulnya gejala klinis VNN. Sampel darah yang telah diberi antikoagulan EDTA diambil untuk pemeriksaan hemoglobin (Hb), hematokrit (PCV), eritrosit, dan leukosit. Pengambilan darah dilakukan di bagian caudal pudancle karena dekat dengan tulang yang mengarah ke jantung.
Penentuan hemoglobin dilakukan dengan cara memasukkan Working Reagent ke dalam 2 cuvet sebanyak 2,5 ml. Sampel dimasukkan ke dalam cuvet pertama, dan akuades ke dalam cuvet kedua sebagai blank masing-masing 10 µ l, lalu dihomogenkan masing- masing campuran dan dibiarkan selama tiga menit pada suhu kamar. Untuk menentukan jumlah haemoglobin digunakan alat spektrofotometer. Terlebih dahulu diatur panjang gelombang spektrofotometer pada 540 nm dan diatur standarnya, lalu dinolkan dengan blank. Sampel dimasukkan dan dibaca hasilnya.
Penghitungan hematokrit dilakukan dengan cara memasukkan darah ke dalam tabung hematokrit sebanyak 3/4 tabung dan ujungnya ditutup dengan lilin. Lalu
disentrifugasi pada 11.000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang dihasilkan pada tabung ditempatkan pada microhaematocrite reader untuk melihat nilai hematokrit.
Penghitungan jumlah eritrosit dilakukan dengan cara sampel darah dihisap menggunakan pipet eritrosit sampai mencapai angka 0,5. Ujung pipet dibersihkan dengan tissue. Setelah bersih, larutan Hayem dihisap sampai tanda 101 dengan cepat tanpa menimbulkan gelembung udara. Pipa penghisap dilepaskan, lalu diaduk sampai bagian yang tercampur hanya bagian yang membesar dari pipet. Cairan pada ujung pipet yang tidak ikut terkocok dibuang. Suspensi darah diteteskan pada bagian pinggir gelas penutup kamar hitung, dimana tetes 1-2 dibuang terlebih dahulu. Perhitungan jumlah sel darah merah dilakukan pada kotak di bagian tengah kamar hitung sebanyak 5 kotak dimana 4 kotak di bagian sudut dan 1 kotak di bagian tengah dengan menggunakan mikroskop. Selanjutnya jumlah eritrosit yang didapat dihitung dengan menggunakan Hasil Perhitungan Akhir (HPA) yaitu jumlah seluruh sel darah merah dari lima kotak tersebut (n butir) dikalikan 10.000 per ml (HPA= n x 10.000).
Penghitungan jumlah leukosit dilakukan dengan cara sampel darah dihisap dengan menggunakan pipet penghisap sampai mencapai angka 0,5. Terlebih dulu ujung pipet dibersihkan dengan kapas. Setelah bersih, larutan Turk dihisap sampai tanda 11 dengan cepat tanpa menimbulkan gelembung udara. Pipa penghisap dilepaskan, lalu diaduk sampai bagian yang tercampur hanya bagian yang membesar dari pipet. Cairan pada ujung pipet yang tidak ikut terkocok dibuang. Suspensi darah diteteskan pada bagian pinggir gelas penutup kamar hitung, dimana tetesan pertama dibuang. Perhitungan jumlah sel darah putih dilakukan pada 4 kotak besar pada bagian pinggir kamar hitung dengan menggunakan mikroskop. Selanjutnya jumlah leukosit yang didapat dihitung dengan menggunakan Hasil Perhitungan Akhir (HPA) yaitu jumlah seluruh sel darah putih dari lima kotak tersebut (n butir) dikalikan 50 per ml (HPA= n x 50).
Keterangan: E: Eritrosit, L: Leukosit
Gambar 1. Kamar Hitung Improved Neubauer (Zaneveld et al., 1977)
3.3.6 Pemeriksaan Histopatologi
Pembuatan sediaan histologis menurut Suntoro (1983), dengan metode parafin adalah: fiksasi, dehidrasi, penjernihan, infiltrasi parafin, penanaman, penempelan, pemotongan, penempelan, deparafinasi, pewarnaan, penutupan serta pemberian label. Organ otak dicuci dengan NaCl 0,9% lalu difiksasi menggunakan Buffer Neutral
Formalin (BNF) 10% selama 1 jam. Jaringan dimasukkan ke dalam alkohol 70, 80,
96% selama 1,5 jam. Dehidrasi dilakukan dengan merendam otak dalam alkohol absolut I,II,III selama 1 jam dan xylol I,II,III se1ama 5 jam. Infiltrasi dilakukan dengan merendam otak pada parafin I,II yang dilakukan di dalam oven dengan suhu 56ºC selama 2 jam. Embedding dilakukan dengan meletakkan otak pada kaset berbentuk segi empat sebagai cetakan. Setelah itu, parafin yang telah cair dituang ke dalam kaset tersebut, dan diberi label. Kemudian blok-blok parafin yang telah di
holder dipotong dengan mikrotum sehingga membentuk pita-pita parafin dengan
ukuran ketebalan 4 µ m. Pita parafin diambil dengan skapel, diletakkan pada gelas objek, dan dicelupkan pada air dingin dan air hangat. Kemudian diletakkan di atas
waterbath beberapa detik untuk melekatkan pita parafin pada gelas objek.
Preparat dimasukkan ke dalam xylol I, II, III dilanjutkan dengan proses dealkoholisasi dengan mencelupkan preparat ke dalam alkohol absolut I, II, III selama 3 menit. Pewarnaan sediaan otak diwarnai dengan menggunakan Hematoksilin Eosin. Pewarnaan dilakukan dengan cara gelas objek dimasukkan ke dalam larutan pewarna
E E E E E L L L L
Hematoksilin Eosin selama 3 menit lalu dicuci dengan dengan air mengalir. Preparat ditetesi canada balsem dan ditutup dengan gelas penutup lalu diamati strukturnya di bawah mikroskop.
3.3.7 Uji Biologi Molekuler
Ekstraksi RNA dilakukan dengan Metode Reverse Transcription Polimerase Chain
Reaction IQ2000 yaitu dengan memasukkan 20 mg sampel otak ke dalam tabung
mikro 1,5 ml dan dilarutkan dengan 500 µ l RNA Extraction Solution. Sampel digerus sampai hancur, didiamkan pada suhu kamar selama 5 menit. CHCl3 ditambahkan sebanyak 100 µ l, kemudian divortex selama 20 detik dan dibiarkan pada suhu kamar selama 3 menit, lalu disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 15 menit. Fase atas (bagian jernih) sebanyak 200 µ l dimasukkan ke dalam tabung mikro 0,5 ml berisi 200 µ l isopropanol, lalu divortex. Larutan disentrifugasi pada 12000 rpm selama 10 menit, lalu dibuang isopropanol. Pelet dicuci dengan 0,5 ml etanol 75%, kemudian di spin
down pada 9000 rpm selama 5 menit untuk mendapatkan pelet RNA, kemudian etanol
dituang dan pelet dikeringkan. Pelet dilarutkan dengan 200 µ l ddH2O. Campuran RT-PCR dan Nested RT-PCR disiapkan sesuai jumlah sampel yang akan diuji dan dimasukkan 8 µ l campuran reaksi reagen RT-PCR ke masing-masing tabung mikro 0,2 ml dan diberi label. Ekstrak sampel sebanyak 2 µ l ditambahkan ke dalam masing-masing campuran reaksi. Sampel dimasukkan ke dalam mesin PCR untuk proses amplikasi tahap I. Setelah tahap pertama selesai, proses tahap kedua dapat dilakukan yaitu dengan menambahkan 15 µ l campuran reagen Nested PCR ke dalam masing-masing tabung sampel dan dilakukan running PCR.
Proses elektroforesis dimulai dengan menyiapkan gel agarose 2% ( 2 gram agarose yang dilarutkan dengan 100 ml TAE 1x) dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer, lalu larutan dipanaskan menggunakan microwave sampai mendidih dan berubah menjadi bening. Gel agarosa didinginkan pada suhu kamar sampai suhu sekitar 50oC dan gel dituangkan ke dalam kotak gel dengan ketinggian gel agarosa sekitar 0,3-0,5 cm, total ketebalan tidak lebih besar dari 0,8 cm. Lalu sisir plastik
(comb) dimasukkan untuk membentuk sumur. Setelah gel agarose memadat diangkat
comb pada kedua sisi kotak. Kotak gel ditambahkan buffer elektroforesis 1X sampai
batas maksimum. Marker dimasukkan ke sumur pertama sebanyak 5 µ l, dan diikuti kontrol positif, kontrol negatif, dan terakhir sampel sebanyak 8 µ l. Running elektroforesis dilakukan pada tegangan 100-150 Volt. Elektroforesis dihentikan bila pita mendekati 2/3 dari gel. Kemudian, gel dikeluarkan dari kotak gel untuk mempersiapkan prosedur pewarnaan EtBr.
Gel agarose hasil running elektrophoresis direndam ke dalam larutan Ethidium Bromida (EtBr) 10 µl yang dicampur dengan 100 ml akuades pada wadah plastik selama 10 menit dan sesekali digoyang. Kemudian gel agarose dikeluarkan dan dicuci dengan akuades steril. Untuk membaca hasilnya, gel agarose diletakkan pada pertengahan transilluminator UV gelombang dan dilihat hasilnya.
3.3.8 Analisis Data
Data yang didapat akan dianalisis dengan Uji Normalitas, Uji Homogenitas dan Uji t (Mann-Whitney non parametik) dengan sistem SPSS Release 13.
BAB 4