METODE PENELITIAN
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah kulit buah rambutan yang diperoleh dari daerah Tanjung Anom, Medan, Sumatera Utara. Kulit buah rambutan yang masih segar dihaluskan terlebih dahulu kemudian dikeringkan di udara terbuka sebanyak 950 gram.
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Kulit Buah Rambutan
Serbuk kulit buah rambutan diidentifikasi dengan mengunakan cara: 1. Skrining Fitokimia
2. Analisis kromatografi lapis tipis
3.3.2.1 Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada kulit buah rambutan, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut :
- Dimasukkan ± 10 gram serbuk kulit buah rambutan ( Nephellium lappaeum L.) yang telah dikeringkan dan dipotong-potong kecil dimasukkan ke dalam Erlenmeyer.
- Ditambahkan metanol ± 100 ml
- Didiamkan
- Disaring
- Dibagi ekstrak metanol kedalam 4 tabung reaksi
- Ditambahkan masing-masing pereaksi
a. Tabung I : dengan FeCl3 5% menghasilkan larutan berwarna hitam.
b. Tabung II : dengan H2SO4(p) menghasilkan larutan orange kekuningan.
c. Tabung III : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan merah muda.
d. Tabung IV : dengan NaOH 10% menghasilkan larutan biru violet.
3.3.2.2 Analisis Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Analisa kromatografi lapis tipis dilakukan terhadap ekstrak kloroform dengan
menggunakan fasa diam silika gel 60F254 Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk
mencari pelarut yang sesuai untuk komatografi kolom. Fasa gerak yang digunakanadalah campuran n-neksana : etil asetat dengan perbandingan (90:10, 80:20, 70:30, 60:40) v/v.
Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak n- heksana : eti asetat (90:10)v/v ke dalam bejana kromatografi kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat kloroform pada plat KLT yang telah diaktifkan. Kemudian dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi pelarut setelah dijenuhkan lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana lalu dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi FeCl3 5
%. Diamati warna bercak yang ditimbul kemudian dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan (80:20, 70:30, 60:40) v/v.
Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa di dalam kulit buah rambutan terkandung senyawa flavonoida. Hasil pemisahannya diberikan pada fasa gerak n-heksana : etil asetat (70:30) v/v (Lampiran 3).
3.3.3 Ekstraksi Kulit Buah Rambutan
Serbuk kulit buah rambutan ditimbang sebanyak 950 gram kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 4 liter sampai semua sampel terendam dan didiamkan ± 24 jam. Maserat ditampung dan dipekatkan menggunakan alat evaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemblokan tanin dengan cara melarutkan ekstrak metanol dengan etil asetat kemudian disaring. Filtrat etil asetat kemudian dirotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Dilarutkan kembali dengan metanol kemudian diekstraksi partisi dengan n-heksan secara berulang-ulang. Dipisahkan lapisan metanol dari lapisan n-heksan lalu dipekatkan dengan rotarievaporator dan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat lapisan metanol. Ekstrak pekat lapisan metanol dihidrolisa dengan HCl 2 N. Kemudian disaring, filtrat yang diperoleh diekstraksi partisi dengan dengan kloroform secara berulang-ulang. Lapisan kloroform dipisahkan kemudian diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 0,5390 gram.
3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 (70-230 mesh) ASTM dan fasa gerak yaitu n-heksana 100% dan campuran pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan (90:10, 80:20, 70:30, 60:40) v/v.
Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 (70-230 mesh) ASTM dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100% hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 0,5390 g ekstrak pekat kloroform ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat (90:10) v/v secara perlahan – lahan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat dengan perbandingan (80:20, 70:30, 60:40) v/v. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap ±10 ml lalu di
KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl3 5%.
Kemudian diuapkan sampai terbentuk kristal.
3.3.5 Pemurnian
Kristal yang diperoleh dilarutkan kembali dengan Me-OH lalu dianalisis KLT untuk mencari fasa gerak yang sesuai untuk preparatif KLT. Kristal yang telah dilarutkan ditotolkan secara perlahan-lahan dan sama rata disepanjang tepi bawah plat kaca. Plat
kemudian dimasukkan kedalam bejana yang telah berisi pelarut CHCl3 : Me-OH
dengan perbandingan (90:10) v/v. Kemudin ditutup. Setelah dielusi, plat dikeluarkan dari bejana dikeringkan dan hasilnya diperiksa dibawah sinar UV. Setiap zona diberi tanda kemudian dikeruk lalu dielusi dengan metanol 100% dan disaring. Hasil elusi diuapkan dan diperoleh kristal.
3.3.6 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Uji kemurnian kristal dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F254 dengan fasa gerak n-heksan : etil asetat (70:30) v/v.
Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan dengan etil asetat pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi. Setelah pelarut merembes, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan kemudian difiksasi dengan
menggunakan pereaksi FeCl3 5% hasil menunjukkan adanya bercak hitam yang
menandakan adanya flavonoida.
3.3.7 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.7.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis dengan alat spketrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Penelitian Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan. Menggunakan metanol sebagai pelarut.
3.3.7.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah ( FT-IR )
Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang.
3.3.7.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H- NMR)
Analisis dengan alat Spektrometer 1H-NMR diperoleh dari Laboratorium Pusat
Penelitian Kimia-LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpon, Tangerang dengan menggunakan aseton sebagai pelarut.