Teknik pemisahan memiliki tujuan untuk memisahkan komponen yang akan ditentukan berada dalam keadaan murni tidak tercampur dengan komponen-komponen lainnya.
Ada dua jenis teknik pemisahan:
1. Pemisahan kimia adalah suatu teknik pemisahan yang berdasarkan adanya
perbedaan yang besar dari sifat-sifat fisika komponen dalam campuran yang akan dipisahkan.
2. Pemisahan fisika adalah suatu teknik pemisahan yang didasarkan pada
perbedaan-perbedaan kecil dari sifat-sifat fisik antara senyawa-senyawa yang termasuk dalam suatu golongan (Muldja,1995).
2.4.1 Ekstraksi
Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan substansi atau zat dari campurannya dengan menggunakan pelarut yang sesuai, dimana zat terlarut yang terdistribusi diantara dua pelarut dinyatakan pertama kali oleh Walter Nernst sebagai hukum distribusi atau partisi yakni, “ Jika solut dilarutkan sekaligus ke dalam dua pelarut yang tidak saling bercampur, maka solut akan terdistribusi diantara kedua pelarut. Pada keadaan setimbang perbandingan konsentrasi solut berharga tetap pada suhu tetap.”
Pada metode ekstraksi cair-cair, ekstraksi dapat dilakukan dengan cara bertahap atau dengan cara kontinu. Cara paling sederhana dan banyak digunakan adalah ekstraksi bertahap, yakni dengan cara menambahkan pelarut pengekstrak yang tidak bercampur dengan larutan sampel melalui corong pisah kemudian dilakukan pengocokan sampai terjadi kesetimbangan konsentrasi solut pada kedua pelarut. Setelah didiamkan beberapa saat akan terbentuk dua lapisan dan yang berada dibawah dengan kerapatan lebih besar dapat dipisahkan untuk analisa selanjutnya (Yazid, 2005).
Ekstraksi dapat dilakukan dengan metode maserasi, sokletasi, dan perkolasi. Sebelum ekstraksi dilakukan biasanya serbuk tumbuhan dikeringkan lalu dihaluskan dengan derajat kehalusan tertentu kemudian diekstraksi dengan salah satu cara di atas. Ekstraksi dengan metode sokletasi dapat dilakukan secara bertingkat dengan berbagai pelarut berdasarkan kepolarannya misalnya n-heksana, etil asetat, methanol, dan air.
Ekstraksi dianggap selesai bila tetesan terakhir memberikan reaksi negatif terhadap senyawa yang diekstraksi. Untuk mendapatkan larutan ekstrak yang pekat, biasanya pelarut ekstrak diuapkan dengan menggunakan alat rotari evaporator (Harborne, 1996).
2.4.2 Kromatografi
Kromatografi adalah pemisahan komponen campuran berdasarkan perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam ( stationary) dan fase gerak (mobile) (Yazid, 2005).
Cara-cara kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat-sifat dari fasa diam yang dapat berupa zat padat atau zat cair. Jika fasa diam berupa zat padat disebut kromatografi serapan, jika berupa zat cair disebut kromatografi partisi. Karena fase gerak dapat berupa zat cair atau gas maka ada empat macam sistem kromatografi, yaitu:
1. Fasa gerak cair-fasa diam padat (kromatografi serapan), yakni: a. Kromatografi lapis tipis
b. Kromatografi penukar ion
2. Fasa gerak gas-fasa diam padat, yakni kromatografi gas padat
3. Fasa gerak cair-fasa diam cair (kromatografi partisi), yakni kromatografi kertas 4. Fasa gerak gas-fasa diam zat cair, yakni:
a. Kromatografi gas-cair b. Kromatografi kolom kapiler
Semua pemisahan dengan kromatografi tergantung pada kenyataan bahwa senyawa-senyawa yang dipisahkan terdistribusi diantara fasa gerak dan fasa diam dalam perbandingan yang sangat berbeda-beda dari satu senyawa terhadap senyawa yang lain (Sastrohamidjojo, 1991).
2.4.2.1 Kromatografi Lapis Tipis
Menurut Markham KLT terutama berguna untuk tujuan berikut: a. Mencari pelarut untuk kromatografi kolom
b. Analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom
c. Untuk mengetahui perkembangan reaksi seperti hidrolisis atau metilasi d. Identifikasi flavonoida secara ko-kromatografi
e. Isolasi flavonoida murni skala kecil (Markham, 1988).
Mengidentifikasi noda-noda dalam lapisan tipis lazim menggunakan harga Rf yang diidentifikasikan sebagai perbandingan antara jarak perambatan suatu zat dengan jarak perambatan pelarut yang dihitung dari titik penotolan pelarut zat. Jarak yang ditempuh oleh tiap bercak dari titik penotolan diukur dari pusat bercak.
Untukmengidentifikasi suatu senyawa, maka harga Rf senyawa tersebut dapat dibandingkan dengan harga Rf senyawa pembanding.
Jarak perambatan bercak dari titik penotolan
Rf =
Jarak perambatan pelarut dari titik penotolan
Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam KLT yang juga mempengaruhi harga Rf ( Sastrohamidjojo, 1985).
1. Struktur kimia dari senyawa yang dipisahkan 2. Sifat dari penyerap dan derajat aktivasi 3. Tebal kerataan dan lapisan penyerap 4. Pelarut dan derajat kemurnian fase gerak 5. Derajat kejenuhan dari uap
6. Jumlah cuplikan yang digunakan
7. Suhu
8. Kesetimbangan
.
2.4.2.2 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Metode kromatografi dapat dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis preparatif, yaitu pemisahan yang terdiri atas sejumlah senyawa serupa. KLT preparatif adalah cara ideal untuk memisahkan cuplikan kecil (50 mg sampai 1 g). Penyerap yang dipakai adalah silika gel dan dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun campuran senyawa hidrofil. Ketebalan adsorben yang paling sering dipakai 0,5-2 mm. Ukuran plat kromatografi biasanya 20 x 20 cm atau 20 x 40 cm.
Cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada plat KLT preparatif. Pelarut yang baik adalah pelarut organik seperti n-heksana, etil asetat, dan diklorometana. Cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi dari plat lapisan besar dan dikembangkan secara tegak lurus pada garisan cuplikan sehingga campuran akan terpisah menjadi beberapa pita. Pita penyerap
tersebut diharapkan mengandung komponen murni, kemudian dikerok dari plat kaca dengan spatula dan ditampung dengan logam tipis atau kertas lilin. Penyerap diletakkan dalam corong kaca memakai kertas saring lalu dielusi beberapa kali dengan pelarut yang cocok (Underwood,1981).
2.4.2.3 Kromatografi Kolom
Kromatografi cair yang dilakukan dalam kolom besar merupakan metode kromatografi terbaik untuk pemisahan dalam jumlah besar (lebih dari 1 g). Pada kromatografi kolom campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penyerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam, dan tabung plastik. Pelarut atau fasa gerak dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Pita senyawa linarut bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah, dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari atas kolom (Gritter, 1991).
Dengan menggunakan cara ini, skala isolasi flavonoida dapat ditingkatkan hampir ke skala industri. Pada dasarnya, cara ini meliputi penempatan campuran flavonoida (berupa larutan) diatas kolom yang berisi serbuk peyerap (seperti selulosa, silika atau poliamida) dilanjutkan dengan elusi beruntun setiap komponen memakai pelarut yang cocok. Kolom hanya berupa tabung kaca yang dilengkapi dengan keran pada salah satu ujung (Markham, 1988).
2.4.2.4 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Fase diam yang tersedia dan selektifitas yang dapat ditingkatkan dengan mengatur fase gerak. Pemisahan dapat dilakukan dengan fase normal atau fase terbalik tergantung pada polaritas relatif fase diam dan fase gerak.
Berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut maka jenis KCKT dapat dibagi secara lebih spesifik, yakni kromatografi adsorbsi, partisi, penukar ion, dan eksklusi ukuran. Pada pemisahan kromatografi adsorbsi penggunaannya sesuai untuk pemisahan- pemisahan campuran isomer struktur dan untuk pemisahan solut dengan gugus fungsional yang berbeda (Sudjadi, 2007).
Pada sebagian besar analisis flavonoida yang cocok ialah KCKT kolom fase balik (hidrokarbon terikat pada kemasan silika). Pengembang seperti air/metanol, air/ metanol/asam asetat, dan air/asetonitril dalam berbagai perbandingan telah digunakan dengan berhasil pada senyawa flavon, flavonol, katekin, dihidroflavonoida, antosianin, dan flavonoida glikosida (Markham, 1988).