Pita II (nm) Pita I (nm) Jenis flavonoid
METODE PENELITIAN
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan sambang darah yang diperoleh dari areal sekitar kampus USU, Medan, Sumatera Utara. Daun tumbuhan sambang darah dikeringkan di dalam dan pada suhu ruangan, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun sambang darah sebanyak 1000 gram.
3.3.2 Uji Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya kandungan senyawa flavonoida pada daun tumbuhan sambang darah, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif, yaitu :
- Dimasukkan ± 10 gram serbuk daun tumbuhan sambang darah yang telah dikeringkan dan dipotong kecil-kecil ke dalam Erlenmeyer
- Ditambahkan metanol ± 100 ml - Didiamkan
- Disaring
- Dibagi ekstrak metanol kedalam 4 tabung reaksi - Ditambahkan masing-masing pereaksi :
a. Tabung I : dengan FeCl3 5% menghasilkan larutan hitam
b. Tabung II : dengan NaOH 10% menghasilkan larutan biru violet c. Tabung III : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan merah muda d. Tabung IV : dengan H2SO4(p) menghasilkan larutan merah
3.3.3 Ekstraksi Daun Tumbuhan Sambang Darah
Serbuk daun tumbuhan sambang darah ditimbang sebanyak 1000 gram, kemudian dimasukkan ke dalam ekstraktor dan diekstraksi maserasi dengan metanol sebanyak 7 liter hingga semua sampel terendam secara merata, dibiarkan selama ± 72 jam dan diulangi sebanyak 2 kali. Hasil ekstraksi ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian ekstrak pekat metanol diuapkan diatas penangas air sampai semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemblokan tanin dengan cara melarutkan ekstrak pekat metanol dengan etil asetat dan disaring. Filtrat etilasetat dirotarievaporator dan diuapkan hingga semua pelarut etilasetat habis menguap. Fraksi pekat etil asetat dilarutkan kembali dengan metanol dan dilakukan ekstraksi partisi secara berulang- ulang dengan n-heksana, dimana partisi dihentikan ketika lapisan n-heksana menjadi bening. Kemudian lapisan metanol diuapkan hingga pekat sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol sebanyak 16,33 gram.
3.3.4 Pemutusan Gula dari Senyawa Flavonoida (Hidrolisa)
Pemutusan gula dari senyawa flavonoida dilakukan dengan hidrolisa asam dengan cara menambahkan HCl 2N ke dalam larutan ekstrak metanol dan dipanaskan sambil
diaduk di atas penangas air selama 1 jam, kemudian didinginkan dan disaring. Ekstrak metanol-asam hasil hidrolisa diekstraksi partisi dengan kloroform sebanyak 3 kali. Kemudian lapisan kloroform dirotarievaporator lalu diuapkan di atas penangas air hingga semua pelarut kloroform menguap sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 1,44 gram.
3.3.5 Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis kromatografi lapis tipis dilakukan terhadap ekstrak kloroform dengan menggunakan fase diam silika gel 60 F254 Merck. Analisis ini bertujuan untuk mencari
perbandingan pelarut yang sesuai untuk pemisahan senyawa didalam analisis kromatografi kolom. Pelarut yang sesuai didasarkan pada jumlah bercak atau noda yang terpisah dengan baik dalam kromatografi lapis tipis.
Pelarut yang digunakan adalah campuran antara n-heksana : etil asetat dengan perbandingan (90:10) v/v, (80:20) v/v, (70:30) v/v, (60:40) v/v. Prosedur yang dilakukan adalah dimasukkan 10 ml larutan fase gerak n-heksana : etil asetat (90:10) v/v ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada batas bawah plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang berisi pelarut yang telah dijenuhkan dan ditutup. Setelah proses elusi selesai, plat dikeluarkan dari dalam bejana dan dikeringkan. Kemudian plat difiksasi dengan pereaksi FeCl3 5%. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf
yang diperoleh. Dilakukan perlakuan yang sama untuk perbandingan pelarut n- heksana : etil asetat (80:20) v/v, (70:30) v/v, dan (60:40) v/v.
3.3.6 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 (70-230 mesh) ASTM dan fasa gerak yaitu n-heksana 100%, campuran pelarut n-
heksan : etil asetat dengan perbandingan (90:10) v/v, (80:20) v/v, (70:30) v/v, dan (60:40) v/v.
Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan 65 gram silika gel dengan menggunakan n-heksana, diaduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100% hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 1,44 gram ekstrak pekat kloroform yang telah dibuburkan juga terlebih dahulu dengan silika gel ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi silika gel yang telah padat. Lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat (90:10) v/v secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat dengan perbandingan (80:20) v/v, (70:30) v/v, dan (60:40) v/v. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 5 ml lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama.
3.3.7 Pemurnian
Senyawa yang diperoleh dari hasil isolasi dimurnikan dengan melarutkan kembali pasta yang diperoleh dengan pelarut etil asetat, diaduk hingga semua pasta larut sempurna. Kemudian ditambahkan n-heksana secara perlahan-lahan melalui dinding beaker glass hingga terjadi pengendapan zat-zat pengotor di dasar wadah. Kemudian didekantasi larutan pada lapisan atas (n-heksana), lalu diuapkan sisa pelarut dari pasta hingga diperoleh pasta yang bebas dari pelarut.
3.3.8 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Uji kemurnian pasta dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F254 dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat (60:40) v/v,
benzene : eter (80:20) v/v, dan kloroform : metanol (80:20) v/v. Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan pasta
yang sebelumnya telah dilarutkan dengan etil asetat pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas atas, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl3 5%. Diamati warna noda yang dihasilkan dan dihitung harga Rf yang diperoleh.
3.3.9 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.9.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis dengan alat spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan menggunakan metanol sebagai pelarut.
3.3.9.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah (FT-IR)
Analisis dengan alat spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Peneltian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan menggunakan KBr sebagai pelarut.
3.3.9.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
Analisa dengan alat spektrometer 1H-NMR diperoleh dari Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan menggunakan Aseton sebagai pelarut.