BAB III. METODE PENELITIAN
D. Prosedur Penelitian
Penelitian ini menggunakan metode Lowry untuk menentukan konsentrasi protein dan menggunakan metode Anson untuk menentukan aktivitas enzim tripsin. Prosedur kerja dilakukan dengan langkah sebagai berikut:
1. Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry (Lowry, 1951: 265-275) Memasukkan 0,2 mL sampel ke dalam tabung reaksi. Kemudian menambahkan 1 mL reagen C dan mengocoknya hingga tercampur sempurna. Mendiamkan campuran tersebut selama 10 menit dalam temperatur ruangan. Menambahkan 0,1 mL reagen E dengan cepat dan mengaduknya. Mendiamkannya selama 30 menit.
31
2. Penentuan Aktivitas Enzim dengan Metode Anson (Anson, 1938: 81-84)
a. Tabung Sampel (ts)
Menambahkan 1 mL larutan enzim tripsin ke dalam 5 mL larutan substrat (pH 7,5). Kemudian mengocoknya hingga tercampur sempurna. Penyampuran kedua larutan ini dilakukan dengan vortexmixer dan ditempatkan pada water bath yang bersuhu 25°C. Mendiamkan larutan tersebut selama 10 menit. Kemudian menambahkan 10 mL larutan TCA 3 N dan mengocoknya dengan kuat. Setelah itu memisahkan endapan dari larutan dengan menyaringnya atau menyentrifugenya. Mengambil 5 mL larutan filtrat dan memasukkannya ke dalam 50 mL labu Erlenmeyer. Menambahkan 10 mL larutan NaOH 0,5 N dan mengaduknya. Setelah itu menambahkan 3 mL reagen fenol dan mengaduknya. Mendiamkan larutan tersebut selama 10 menit dari waktu penambahan reagen. Mengukur nilai warna yang terbentuk.
b. Tabung Standar
0,0008 miliekuivalen tirosin (dalam 5 mL 0,2 N asam klorida dan 0,5% formaldehid sebagai pengawet) ditambahkan dengan 10 mL NaOH 0,5 N dan 3 mL reagen fenol. Mendiamkan larutan selama 5 menit dari waktu penambahan reagen. Mengukur nilai warna yang terbentuk.
c. Tabung Blanko
10 mL larutan TCA 0,3 N ditambahkan ke dalam 5 mL larutan substrat dan 1 mL air. Kemudian mengambil 5 mL larutan TCA-filtrat tersebut dan menambahkan 0,0008 miliekuivalen tirosin (dalam 5 mL 0,2 N asam klorida dan 0,5% formaldehid sebagai pengawet). Setelah itu menambahkan 10 mL NaOH 0,5
32
N dan 3 mL reagen fenol. Kemudian mendiamkannya selama 5 menit dan mengukur nilai warna yang terbentuk.
3. Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry Modifikasi a. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Kasein
Penentuan panjang gelombang kasein dilakukan dengan menggunakan sampel larutan kasein 1 mg/mL yang dilarutkan dalam buffer fosfat pH 8. Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan pada panjang gelombang antara 650-750 nm. Penentuan ini dilakukan dengan mengacu pada metode Lowry dengan sedikit perubahan. Pada penentuan panjang gelombang maksimum kasein, menggunakan 1 mL larutan kasein 1 mg/mL kedalam tabung reaksi. Kemudian menambahkan 5 mL reagen C dan mengaduknya hingga tercampur sempurna. Mendiamkannya pada suhu kamar selama 10 menit. Kemudian menambahkan 0,5 mL reagen E dan mengocoknya dengan segera. Mendiamkan larutan tersebut selama 30 menit pada suhu kamar. Setelah itu mengukur absorbansi pada panjang gelombang 650-750 nm. Panjang gelombang maksimum adalah panjang gelombang yang memberikan nilai absorbansi terbesar. Ringkasan cara kerja dalam bentuk bagan dapat dilihat pada lampiran 1.
b. Penentuan Kurva Standar Protein Kasein
Konsentrasi larutan standar kasein yang digunakan adalah 0,1 mg/mL; 0,2 mg/mL; 0,3 mg/mL; 0,4 mg/mL; 0,5 mg/mL; 0,6 mg/mL; 0,7 mg/mL; 0,8 mg/mL; 0,9 mg/mL dan 1,0 mg/mL. Pengukuran absorbansi larutan standar dilakukan pada panjang gelombang yang telah diperoleh pada penentuan panjang gelombang
33
mkasimum sebelumnya. Penentuan ini dilakukan sama dengan prosedur penentuan panjang gelombang maksimum yaitu mengacu pada metode Lowry dengan sedikit perubahan. Ringkasan cara kerja dalam bentuk bagan dapat dilihat pada lampiran 2.
c. Penentuan Kadar Protein Tripsin
Penentuan kadar protein dalam enzim tripsin dilakukan dengan menggunakan larutan enzim tripsin 8 mg/20 mL. Penentuan ini dilakukan sama dengan prosedur penentuan panjang gelombang maksimum yaitu mengacu pada metode Lowry dengan sedikit perubahan. Pengukuran absorbansinya pada panjang gelombang maksimum yang telah diketahui pada prosedur sebelumnya. Kadar protein enzim tripsin dapat ditentukan dengan bantuan kurva standar protein kasein yang diperoleh pada penentuan kadar protein larutan santadar kasein. Ringkasan cara kerja dalam bentuk bagan dapat dilihat pada lampiran 3.
4. Penentuan Kondisi Optimum Enzim Tripsin dengan Metode Anson Modifikasi
a. Penentuan pH Optimum
Variasi pH yang digunakan dalam penelitian ini adalah pH 7, pH 8 dan pH 9. Penentuan pH optimum enzim tripsin dilakukan dengan mengacu pada metode Anson dengan sedikit perubahan. Perubahan pada penentuan pH optimum enzim tripsin yaitu:
34
1) Tabung sampel (ts)
Ke dalam 3 tabung reaksi, memasukkan 5 mL larutan substrat kasein 1% pH bervariasi dari pH 7; pH 8; dan pH 9. Kemudian melakukan prainkubasi selama 5 menit pada suhu 35°C. Menambahkan 1 mL larutan enzim tripsin pH bervariasi (pH 7; pH 8; dan pH 9) dan 1 mL buffer fosfat 0,1 M pH bervariasi (pH 7; pH 8; dan pH 9). Setelah itu, melakukan inkubasi selama 20 menit pada suhu 35°C yang dihitung dari penambahan enzim tripsin. Menambahkan 3 mL larutan TCA 10% kemudian mengaduknya dengan kuat untuk menghentikan reaksi. Selanjutnya, mendiamkan selama 20 menit dalam air es agar endapan yang dihasilkan benar-benar mengendap. Melakukan sentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit pada larutan dan endapan yang terbentuk. Mengambil 2 mL filtrat yang telah disentrifuge dan menambahkan 4 mL NaOH 0,5 M. Lalu menambahkan 1 mL reagen Folin-Ciocalteau. Mendiamkan selama 10 menit. Menentukan absorbansi pada panjang gelombang 650 nm.
2) Tabung kontrol (tk)
Ke dalam 3 tabung reaksi, memasukkan 1 mL buffer fosfat 0,1 M pH 7, pH 8 dan pH 9. Setelah itu, menambahkan 1 mL larutan tripsin pH 7, pH 8 dan pH 9. Kemudian menambahkan 3 mL larutan TCA 10 % dan mengaduknya hingga tercampur. Menambahkan 5 mL larutan substrat kasein 1% pH bervariasi dari pH 7, pH 8, dan pH 9 dan mengocoknya. Melakukan inkubasi selama 5 menit pada suhu 35°C. Selanjutnya, mendiamkan selama 20 menit dalam air es agar endapan yang dihasilkan benar-benar mengendap. Melakukan sentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit pada larutan dan endapan yang terbentuk. Mengambil
35
2 mL filtrat yang telah disentrifuge dan menambahkan 4 mL NaOH 0,5 M. Lalu menambahkan 1 mL reagen Folin-Ciocalteau. Mendiamkan selama 10 menit. Menentukan absorbansi pada panjang gelombang 650 nm.
3) Tabung blanko
Kedalam 3 tabung reaksi dimasukkan 2 mL larutan buffer fosfat 0,1 M pH bervariasi dan 4 mL NaOH 0,5 M kemudian mengaduknya. Menambahkan 1 mL reagen Folin-Ciocalteau dan mendiamkan selama 10 menit kemudian mengukur absorbansinya pada panjang gelombang 650 nm.
Ringkasan cara kerja penentuan pH optimum enzim tripsin menggunakan tabung sampel, tabung kontrol dan tabung blanko dalam bentuk bagan dapat dilihat pada lampiran 4.
b. Penentuan Suhu Optimum
Penentuan suhu optimum enzim tripsin dilakukan dengan mengacu pada metode Anson dengan sedikit perubahan. Prosedur penentuan ini dilakukan sama dengan prosedur pada penentuan pH optimum. Hanya saja penentuan suhu optimum dilakukan pada pH optimum yang diperoleh pada prosedur sebelumnya dan pada variasi suhu 31°C; 33°C; 35°C; 37°C; dan 39°C. Ringkasan cara kerja dalam bentuk bagan dapat dilihat pada lampiran 5.
c. Penentuan Waktu Inkubasi Optimum
Penentuan waktu inkubasi optimum enzim tripsin dilakukan dengan mengacu pada metode Anson dengan sedikit perubahan. Prosedur penentuan ini dilakukan sama dengan prosedur pada penentuan pH optimum. Hanya saja
36
penentuan waktu inkubasi optimum dilakukan pada pH dan suhu optimum yang diperoleh pada prosedur sebelumnya. Variasi waktu inkubasi yang digunakan yaitu 10 menit; 15 menit; 20 menit; 25 menit; dan 30 menit. Ringkasan cara kerja dalam bentuk bagan dapat dilihat pada lampiran 6.
d. Penentuan Konsentrasi Substrat Optimum
Penentuan konsentrasi substrat optimum dilakukan dengan mengacu pada metode Anson dengan sedikit perubahan. Prosedur penentuan ini dilakukan sama dengan prosedur pada penentuan pH optimum. Hanya saja penentuan konsentrasi substrat optimum dilakukan pada pH, suhu, dan waktu inkubasi optimum yang diperoleh pada prosedur sebelumnya Variasi konsentrasi substrat yang digunakan adalah 2 mg/mL; 4 mg/mL; 6 mg/mL; 8 mg/mL dan 10 mg/mL. Ringkasan cara kerja dalam bentuk bagan dapat dilihat pada lampiran 7.
5. Penentuan Aktivitas Enzim Tripsin Pada Kondisi Optimum dengan Metode Anson Modifikasi
Prosedur yang digunakan mengacu pada metode Anson dengan sedikit perubahan. Prosedur penentuan ini dilakukan sama dengan prosedur pada penentuan pH optimum. Penentuan aktivitas enzim tripsin ini dilakukan pada pH, suhu, waktu inkubasi dan konsentrasi substrat optimum yang telah diketahui pada prosedur sebelumnya. Ringkasan cara kerja dalam bentuk bagan dapat dilihat pada lampiran 8.
37
6. Penentuan Aktivitas Enzim Tripsin Dengan Penambahan Ion Logam Ag+ dalam Bentuk Senyawa AgNO3 dengan Metode Anson Modifikasi
Penentuan aktivitas enzim tripsin dengan penambahan ion logam Ag+ dalam
bentuk senyawa AgNO3 dilakukan dengan mengacu pada metode Anson dengan
sedikit perubahan. Penentuan aktivitas enzim tripsin dengan penambahan ion
logam Ag+ dalam bentuk senyawa AgNO3 dilakukan pada kondisi optimum enzim
tripsin yang telah diperoleh pada prosedur sebelumnya. Prosedur penentuan ini dilakukan sama dengan prosedur pada penentuan pH optimum hanya saja pada tabung kontrol dan tabung sampel penggunaan 1 mL buffer fosfat 0,1 M pH
optimum diganti dengan penambahan 1 mL larutan ion logam Ag+ dalam bentuk
senyawa AgNO3 berbagai konsentrasi. Variasi konsentrasi senyawa AgNO3 yang
ditambahkan adalah 0,001 M; 0,003 M; 0,005 M; dan 0,007 M. Ringkasan cara kerja dalam bentuk bagan dapat dilihat pada lampiran 9
.