BAB 3 METODE PENELITIAN
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Pembuatan Larutan Pereaksi 3.3.1.1 Larutan Asam Asetat 1%
Sebanyak 10 mL asam asetat glasial dimasukkan kedalam labu takar 1000 mL.
Kemudian diencerkan dengan aquadest sampai garis tanda, lalu dihomogenkan.
3.3.1.2 Larutan Kitosan 2%
Sebanyak 2 gram kitosan dilarutkan dengan 100 mL larutan asam asetat 1% lalu distirrer selama 24 jam sehingga diperoleh larutan kitosan yang kental.
3.3.2 Pelapisan Kitosan
3.3.2.1 Pelapisan Kitosan Pada Kain Kasa Dengan Cara Perendaman
Kain Kasa ditempelkan pada plat gelas dengan ukuran 10x10 cm, kemudian larutan kitosan dituangkan pada plat gelas tersebut, angkat dan tiriskan, lalu dikeringkan dalam oven pada temperatur 600C sampai kering.
3.3.2.2 Pelapisan Kitosan Pada Kertas Saring Dengan Cara Perendaman
Kertas Saring ditempelkan pada plat gelas dengan ukuran 10x10 cm, kemudian larutan kitosan dituangkan pada plat gelas tersebut, angkat dan tiriskan, lalu dikeringkan dalam oven pada temperatur 600C sampai kering.
3.3.3 Pembuatan Larutan Media
19
3.3.3.1 Sterilisasi Alat
Alat-alat yang digunakan dicuci sampai bersih dan dikeringkan, lalu ditutup rapat dengan kertas perkamen. Kemudian dimasukkan kedalam autoklaf dan ditutup rapat.
Disterilisasi selama 15 menit pada suhu 1210C.
3.3.3.2 Pembuatan Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Sebanyak 11,4 gram serbuk Mueller Hinton Agar dimasukkan kedalam Erlenmeyer, lalu dilarutkan dengan 350 mL akuades dan dipanaskan hingga semua larut dan mendidih. Lalu disterilkan di autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit.
3.3.3.3 Pembuatan Media Nutrient Agar (NA)
Sebanyak 9,8 gram Nutrient Agar dimasukkan dalam Erlenmeyer, lalu dilarutkan dengan 350 mL akuades dan dipanaskan hingga semua larut dan mendidih. Lalu disterilkan di autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit.
3.3.3.4 Pembuatan Media Agar Miring dan Stok Kultur Bakteri
Kedalam tabung reaksi yang steril dimasukkan 3 mL media Nutrient Agar steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai memadat pada posisi miring membentuk sudut 30-450. Biakan bakteri E.coli dari strain utama diambil dengan jarum ose steril lalu diinokulasikan pada permukaan media Nutrient Agar miring dengan cara menggores, kemudian diinkubasi pada suhu 350C selama 18-24 jam. Hal yang sama juga dilakukan pada biakan bakteri S.aureus.
3.3.3.5 Penyiapan Inokulum Bakteri
Sebanyak 10 mL akuades dimasukkan kedalam tabung reaksi, disterilkan dalam autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit. Diambil koloni bakteri E.coli dari stok kultur bakteri dengan jarum ose bengkok lalu dimasukkan kedalam akuades steril, kemudian dihomogenkan dengan vortex, lalu diukur nilai absorbansi blanko berupa akuades steril dengan panjang gelombang 600 nm. Diukur nilai absorbansi suspensi bakteri dengan panjang gelombang 600 nm. Hal yang sama dilakukan untuk koloni bakteri S.aureus.
3.3.4 Uji Aktivitas Antibakteri
3.3.4.1 Uji Aktivitas Antibakteri Kain Kasa Yang Dilapisi Kitosan
Dimasukkan media Mueller Hinton Agar kedalam cawan petri steril dengan suhu 45-500C, kemudian dibiarkan sampai media memadat. Diambil Cotton Bud steril, lalu dicelupkan inokulum bakteri, setelah itu digoreskan ke media MHA yang telah memadat. Digunting kain kasa yang dilapisi kitosan membentuk lingkaran berdiameter 6 mm, dimasukkan kain kasa yang dilapisi kitosan yang berukuran 6 mm. Kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 350C selama 18-24 jam.
Selanjutnya diukur zona bening disekitar kertas cakram dengan jangka sorong.
3.3.4.2 Uji Aktivitas Antibakteri Kertas Saring Yang Dilapisi Kitosan
Dimasukkan media Mueller Hinton Agar kedalam cawan petri steril dengan suhu 45-500C, kemudian dibiarkan sampai media memadat. Diambil Cotton Bud steril, lalu dicelupkan inokulum bakteri, setelah itu digoreskan ke media MHA yang telah memadat. Digunting kertas saring yang dilapisi kitosan membentuk lingkaran berdiameter 6 mm, dimasukkan kertas saring yang dilapisi kitosan yang berukuran 6 mm. Kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 350C selama 18-24 jam.
Selanjutnya diukur zona bening disekitar kertas cakram dengan jangka sorong.
3.3.5 Analisa Permukaan Dengan SEM
Proses pengamatan mikroskopik menggunakan SEM diawali dengan merekatkan sampel dengan Stab yang terbuat dari logam specimen older. Kemudian setelah sampel dibersihkan dengan alat peniup, sampel dilapisi dengan emas dan palladium dengan mesin dionspater yang bertekanan 1492x10-2 atm. Sampel selanjutnya dimasukkan ke dalam ruangan yang khusus dan kemudian disinari dengan pancaran elektron bertenaga 10 Kvolt sehingga sampel mengeluarkan elektron sekunder dan elektron terpental yang dapat dideteksi dengan detektor scientor yang kemudian diperkuat dengan suatu rangkaian listrik yang menyebabkan timbulnya gambar CRT (Chatode Ray Tube). Pemotretan dilakukan setelah memilih bagian tertentu dari objek (sampel) dan perbesaran yang diinginkan sehingga diperoleh foto yang baik dan jelas (Negulescu, 2004).
21
3.3.6. Penentuan Kadar Logam Nikel (Ni) dengan Spektrofotometri Serapan Atom (SSA)
3.3.6.1 Pembuatan Larutan Standar Nikel (Ni) 100 ppm
Sebanyak 10 mL larutan standar Nikel (Ni) 1000 ppm dimasukkan kedalam labu takar 100 mL, kemudian diencerkan dengan aquadest sampai garis batas dan dihomogenkan.
3.3.6.2 Pembuatan Larutan Standar Nikel (Ni) 10 ppm
Sebanyak 10 mL larutan standar Nikel (Ni) 100 ppm dimasukkan kedalam labu takar 100 mL kemudian diencerkan dengan aquadest sampai garis batas dan dihomogenkan.
3.3.6.3 Pembuatan Larutan Seri Standar Nikel (Ni) 1 ; 3 ; dan 5 ppm
Larutan standar Nikel (Ni) 10 ppm berturut-turut dipipet 5, 15, dan 25 mL, kemudian masing-masing dimasukkan kedalam labu takar 50 mL, lalu diencerkan dengan aquadest sampai garis batas dan dihomogenkan.
3.3.6.4 Pembuatan Kurva Standar Nikel (Ni)
Larutan blanko (0,0) mg/L diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer serapan atom (SSA) pada λspesifik 248,3 nm. Perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali. Dilakukan hal yang sama untuk larutan seri standar Nikel (Ni) 1 ; 3 ; dan 5 ppm.
3.3.7 Penentuan Kadar Logam Krom (Cr) dengan Spektrofotometri Serapan Atom (SSA)
3.3.7.1 Pembuatan Larutan Standar Krom (Cr) 100 ppm
Sebanyak 10 mL larutan standar Krom (Cr) 1000 ppm dimasukkan kedalam labu takar 100 mL kemudian diencerkan dengan aquadest sampai garis batas dan dihomogenkan.
3.3.7.2 Pembuatan Larutan Standar Krom (Cr) 10 ppm
Sebanyak 10 mL larutan standar Krom (Cr) 100 ppm dimasukkan kedalam labu takar 100 mL kemudian diencerkan dengan aquadest sampai garis batas dan dihomogenkan.
3.3.7.3 Pembuatan Larutan Seri Standar Krom (Cr) 1 ; 3 ; dan 5 ppm
Larutan standar Krom (Cr) 10 ppm berturut-turut dipipet 5, 15, dan 25 mL, kemudian masing-masing dimasukkan kedalam labu takar 50 mL, lalu diencerkan dengan aquadest sampai garis batas dan dihomogenkan.
3.3.7.4 Pembuatan Kurva Standar Krom (Cr)
Larutan blanko (0,0) mg/L diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer serapan atom (SSA) pada λspesifik 228,8 nm. Perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali. Dilakukan hal yang sama untuk larutan seri standar Krom (Cr) 1 ; 3
; dan 5 ppm.
3.3.8 Penentuan Konsentrasi Optimum Pada Kain Kasa Dan Kertas Saring Yang Dilapisi Kitosan
Kain kasa dan kertas saring yang telah dilapisi kitosan dimasukkan ke dalam kolom yang telah berisi larutan standar, didiamkan selama 10 menit dengan berdasarkan variasi konsentrasi yaitu 1, 3, dan 5 ppm kemudian dibuka tutup kolom dan ditampung dengan botol vial. Selanjutnya diuji absorbansinya dengan menggunakan Spektrofotometri Serapan Atom.
23
