BAB IV METODE PENELITIAN
4.6 Prosedur Penelitian
Penelitian dilakukan sebagai berikut :
1. Pada kelompok subjek penelitian yaitu menggunakan tikus Wistar jantan dilakukan pengambilan sampel yang memenuhi persyaratan inklusi penelitian secara random sebanyak tiga puluh ekor mencit.
2. Tiga puluh tikus Wistar jantan terlebih dahulu dilakukan adaptasi selama 7 hari.
3. Tiga puluh ekor tikus Wistar jantan yang sudah terbagi menjadi tiga kelompok perlakuan diaklimatisasi di unit Animasi Laboratorium Farmakologi Universitas Udayana. Tikus Wistar jantan dikandangkan dan setiap kandang berisi 10 ekor dan diberikan makanan standar setiap hari selama 4 minggu ad libitum. 4. Dilakukan pencukuran pada punggung tikus Wistar (area yang mendapat
penyinaran). Kelompok perlakuan pertama hanya diberikan aquadest 1cc sebagai kontrol setiap hari selama 1 bulan secara oral (zoned lambung) paparan sinar UV-B. Kelompok perlakuan kedua diberi ekstrak pegagan secara oral sekali sehari dosis 50/200 mgBB tikus dan diberi paparan sinar UV-B. Kelompok perlakuan ketiga diberi vitamin C secara oral sekali sehari dengan dosis 9/200 mgBB lalu diberi paparan sinar UV-B.
5. Dilakukan penyinaran dengan menggunakan sinar UV-B merek KN-4003, dengan dosis total penyinaran pada kelompok pertama sampai dengan kelompok ketiga sebesar 840 mJ/cm2, dengan perincian: 50 mJ/cm2 . pada
minggu pertama, 70 mJ/cm2 pada minggu ke dua dan 80 mJ/cm2 pada minggu ke 3 dan ke 4. Penyinaran diberikan 3 kali seminggu selama 4 minggu, sehingga dosis totalnya mencapai 840 mJ/cm2.
6. Langkah Paparan Sinar UV-B tikus Wistar jantan.
Tabel 4.1
Jadwal dan waktu penyinaran UV-B
Jadwal Penyinaran Dosis sinar UV-B Lama penyinaran
Minggu I
( Senin, Rabu, Jumat ) 50 mJ/cm
2 50 detik
Minggu II
( Senin, Rabu, Jumat ) 70 mJ/cm
2 70 detik
Minggu III dan IV
(Senin, Rabu, Jumat ) 80 mJ/cm
2 80 detik
7. Tikus Wistar jantan dibiarkan terlebih dahulu selama dua puluh empat jam setelah penyinaran berakhir untuk menyingkirkan pengaruh efek penyinaran akut (Vayalil dkk., 2004).
8. Untuk mengambil sampel kulit pada mencit dilakukan biopsi. Sebelum dibiopsi, dilakukan biopsi terlebih dahulu menggunakan xylazine dan ketamin. Dengan dosis xylazine 4-8 mg/ kgBB IM dan Ketamin 22-44mg/ kgBB IM (KNEPK, 2011).
9. Pembuatan sediaan histologis dibagi menjadi tiga tahapan yaitu tahap fiksasi, dehidrasi, clearing dan embeding. Jaringan kulit hasil biopsi kulit mencit masing-masing dengan diameter 5 mm dan kedalaman sampai sub kutan
diperlakukan mengikuti tahapan tersebut. Tahap fiksasi artinya kulit hasil biopsi direndam dalam formalin bufer fosfat 10% selama 24 jam kemudian dilakukan triming bagian jaringan yang akan diambil. Selanjutnya jaringan tersebut direndam dengan alkohol bertingkat (tahap dehidrasi) direndam berturut turut 50%, 70%, 90%, 96% dan 100% masing masing 2 kali selama 2 jam. Selanjutnya masuk ke tahap clearing dengan memasukkan jaringan ke clearing agent (xylene) selama 24 jam sampai transparan. Tahap embeding diawali dengan proses infiltrasi sebanyak 2 kali selama masing-masing 1 jam dengan parafin murni (Histoplast) cair (suhu 60o C) kemudian jaringan ditanam ke dalam parafin cair dan dibiarkan membentuk blok yang memakan waktu selama satu hari agar mudah diiris dengan mikrotom. Pemotongan menggunakan mikrotom rotari (Jung Histocut Leica 820), tebal 5 mikro meter secara seri dan diambil irisan ke 5, 10, 15 untuk selanjutnya dilakukan penempelan pada gelas obyek, lalu diinkubasi pada suhu 60o C selama 2 jam. Khusus untuk slide yang dicat dengan immunohistokimia, menggunakan objek glass yang sudah dilapisi daya rekat seperti Poly-Lysine atau yang sejenis.
10. Pemeriksaan Kolagen dengan Sirius Red dan Ekspresi MMP-1
11. Sebelum dilakukan pengecatan, slide melalui proses deparafinisasi dan rehidrasi meliputi perendaman dalam larutan xylene 2 x 5 menit, etanol 100% selama 2 menit, etanol 96% 2 x 2 menit, etanol 70% selama 2 menit dan aquadest selama 2 menit. Selanjutnya dilakukan pewarnaan inti sel
dengan Hematoxilin Gill selama 10 menit dan dicuci selama 10 menit dengan air mengalir. Dilakukan pewarnaan dengan picro Sirius Red selama 1 jam yang bertujuan memberikan pewarnaan mendekati seimbang. Tahap selanjutnya dilakukan pencucian dengan air asam sebanyak 2 kali. Air yang berlebihan selanjutnya dihilangkan secara fisik dengan menggoyang secara perlahan. Dehidrasi dalam etanol 70% selama 10 detik, etanol 96% 2x 10 detik, etanol 100% selama 10 detik dan xylene 2 x 2 menit, keringkan selama 2 jam dalam suhu ruang, lalu mounting pada medium berbasis xylene (DPX).
12. Pengamatan hasil jumlah kolagen dilakukan dengan metode analisis digital. Sediaan dengan pembesaran 10 dan 40 kali, difoto dengan kamera Olympus DP12. Masing masing preparat difoto sebanyak 3 kali dengan menggunakan format JPEG. Penghitungan jumlah kolagen dermis dengan menggunakan piranti lunak Adobe PhotoShop CS3 dan Image J.
13. Jaringan kolagen yang tampak berwarna merah terang dipilih menggunakan fungsi “Magic Wand” oleh Adobe PhotoShop CS3. Kemudian dengan menggunakan fungsi “inverse” maka terpilihlah pixel selain warna merah, lalu dihapus menggunakan fungsi “delete” sehingga pada gambar hanya tersisa pixel dengan warna merah. Jumlah kolagen dihitung sebagai persentase pixel area kolagen yang berwarna merah dibandingkan dengan pixel area seluruh jaringan. Pertama-tama gambar yang sudah dihilangkan pixel selain warna merah, dipisah channel warna merahnya melalui fungsi “RGB stack” pada Image J. Setelah didapatkan channel warna merah
kemudian dibuat nilai “threshold” untuk warna merah, lalu dijalankan fungsi “measure” sehingga didapatkan presentase pixel warna merah dari total pixel secara otomatis.
14. Jumlah kolagen (%) = pixel area kolagen x 100%
pixel area seluruh jaringan
15. Pengecatan Immunohistokimia MMP-1
Sebelum dilakukan pengecatan, slide melalui proses deparafinisasi dan rehidrasi meliputi perendaman dalam larutan xylene 2 x 5 menit, etanol 100% selama 2 menit, etanol 96% 2 x 2 menit, etanol 70% selama 2 menit dan PBS selama 2 menit. Selanjutnya dilakukan antigen retrieval, yaitu slide direndam dalam buffer Tri Sodium Citrat lalu dipanaskan dalam microwave selama 5 menit dengan menggunakan daya 800 Watt, dinginkan lalu cuci dengan PBS 2 x 5 menit.Selanjutnya dilakukan bloking peroksidase endogen dalam boks plastik dengan H2O2 3% selama 30 menit. Kemudian dicuci dengan PBS 1X selama 5 menit masing-masing dua kali. Diteteskan 5% FBS 100 µL selama dua jam dalam suhu ruang dan boks dalam keadaan tertutup. Dilanjutkan dengan dicuci PBS 1X selama 5 menit masing-masing dua kali, kemudian diteteskan antibodi primer 100 µL selama satu malam dalam boks tertutup. Setelah satu malam dicuci dengan PBS 1X selama 5 menit dalam glass jar masing-masing sebanyak dua kali sambil digoyangkan. Dilanjutkan dengan biotinylated link yang diteteskan pada seluruh permukaan jaringan kemudian diinkubasi selama 30 menit dalam boks
tertutup, kemudian dicuci dalam PBS 1X selama 5 menit dalam glass jar masing-masing dua kali sambil digoyangkan. Selanjutnya diteteskan
streptavidin peroxidase kemudian didiamkan selama 30 menit dalam boks
tertutup, dicuci kembali dalam glass jar menggunakan PBS 1X sebanyak empat kali masing-masing selama 3 menit sambil digoyangkan. Diteteskan DAB hingga berwarna coklat kemudian dicuci dengan PBS 1X hingga bersih dan dikeringkan. Diteteskan Hematoxylin Gill didiamkan selama lima menit kemudian dicuci dengan air mengalir. Direndam dalam etanol absolut sebanyak dua kali masing-masing selama lima menit, dilanjutkan perendaman pada xylene sebanyak dua kali masing-masing selama lima menit.
Setelah kering slide di-mounting dengan medium berbasis xylene (DPX) dan ditutup cover glass.
16. Perhitungan ekspresi MMP-1 dengan menggunakan teknik imunohistokimia LSAB Dako, Denmark) dengan antibodi primer anti-mouse MMP-1 (BIOS, USA). Ekspresi MMP-1 berdasarkan tampilan sel fibroblast yang berwarna coklat dan dihitung berdasarkan sel fibroblast yang mengekspresikan MMP-1 dibagi jumlah total fibroblast dalam lapangan pandang dan dihitung masing - masing 3 lapangan pandang dengna pembesaran 400 kali menggunakan mikroskop Olympus CX 41 ( Jepang ) dan mikrofotografi
menggunakan kamera Optilab Pro ( Miconos, Indonesia ). Hasil mikrofotografi dianalisis menggunakan perangkat lunak image Raster 2.1 . Kadar MMP-1 (%) = Fibroblast yang mengekspresikan MMP-1 x 100%
Total fibroblas pada lapang pandang