Prosedur Penelitian

METODOLOGI PENELITIAN

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Penyediaan Sampel

Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan balik angin (M.recurvata Gage.) yang diperoleh dari daerah Sunggal, Sumatera Utara. Daun tumbuhan balik angin

3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Balik Angin

Serbuk daun tumbuhan balik angin diidentifikasikan dengan menggunakan cara: 1. Skrining Fitokimia

2. Analisis Kromatografi Lapis Tipis

3.3.2.1Skrining Fitokimia

Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada daun tumbuhan balik angin maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut:

- Dimasukkan ± 10 gram serbuk daun tumbuhan balik angin (M.recurvata Gage.) yang telah dikeringkan dan dipotong kecil-kecil ke dalam erlenmeyer - Ditambahkan metanol ± 100 mL

- Didiamkan - Disaring

- Dibagi ekstrak metanol kedalam 4 tabung reaksi - Ditambahkan masing-masing pereaksi:

a. Tabung I : dengan FeCl3 5% menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda c. Tabung III : dengan NaOH 10% menghasilkan larutan biru violet

d. Tabung IV : dengan H2SO4(p) menghasilkan larutan orange kekuningan

3.3.2.2 Analisis Kromatografi Lapis Tipis

Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F₂₅₄ Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan adalah campuran n-heksana:etil asetat. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-heksana:etil asetat dengan perbandingan (90:10) _{v v}⁄ , (80:20) _{v v}⁄ , (70:30) _{v v}⁄ dan (60:40) v

v

Dimasukkan 10 mL larutan fase gerak n-heksana:etil asetat (90:10) v⁄_v kedalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat kedalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi FeCl3 5%. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksan: etil asetat dengan perbandingan (80:20) _{v v}⁄ , (70:30) _{v v}⁄ dan (60:40) v

v

⁄.

3.3.3 Memperoleh Ekstrak Pekat Metanol dari Daun Tumbuhan Balik Angin (M.recurvata Gage.)

Serbuk daun tumbuhan balik angin ditimbang sebanyak 1400 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 3 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama ± 48 jam dan diulangi sebanyak 4 kali. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut menguap. Lalu dilakukan pemblokan tanin dengan cara melarutkan fraksi metanol dengan etil asetat dan disaring. Filtrat kemuadian dirotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi etil asetat dilarutkan dengan metanol dan dipartisi berulang-ulang dengan n-heksana. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana lalu diuapkan hingga pekat sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol sebanyak 12,06 g.

3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom

Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat metanol yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel

Kolom I :

Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan 370 g silika gel dengan menggunakan n-heksana, diaduk hingga homogen lalu dimasukkan kedalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100% hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 12,06 g ekstrak pekat metanol daun tumbuhan balik angin kedalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat (90:10)v

v

⁄ secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fase gerak n-heksana : etil asetat dengan perbandingan (80:20) v v ⁄, (70:30) v v ⁄ dan (60:40) v v

⁄. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 12 mL lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama.

Kolom II:

Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan 70 g silika gel dengan menggunakan kloroform, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan kedalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan kloroform 100% hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 2,48 g fraksi hasil penggabungan kolom I kedalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel lalu ditambahkan fasa gerak kloroform : metanol (90:10) v⁄_v secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial sebanyak 5 mL lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama. Diuapkan sampai terbentuk kristal.

3.3.5 Pemutusan Gula dari Senyawa Flavonoida

Pemutusan gula dari senyawa flavonoida dilakukan dengan cara hidrolisis asam menggunakan HCl 2N sambil dipanaskan kemudian dipartisi dengan kloroform.

Senyawa yang diperoleh dari kolom kromatografi dilarutkan dengan metanol kemudian dihidrolisa dengan menggunakan HCl 2N lalu dipanaskan selama ± 45 menit dan disaring. Filtrat yang diperoleh diekstraksi partisi dengan kloroform secara berulang-ulang. Lapisan kloroform diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 0,17 g.

3.3.6 Pemurnian dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Pemurnian senyawa flvonoida dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif dilakukan karena hasil analis KLT dari kristal yang diperoleh dengan kromatografi kolom menunjukkan hasil yang belum murni.

Ekstrak pekat kloroform dilarutkan kembali dengan kloroform lalu dianalisis KLT untuk mengetahui apakah senyawa yang diperoleh sudah murni atau belum sekaligus mencari fasa gerak yang sesuai untuk Kromatomatografi Lapis Tipis Preparatif. Benzene : eter (80:20) v⁄_v adalah fasa gerak yang menunjukkan pemisahan paling baik untuk selanjutnya digunakan untuk menjenuhkan bejana KLT preparatif. Selanjutnya kristal yang telah dilarutkan tadi ditotolkan secara perlahan-lahan dan sama rata disepanjang tepi bawah plat KLT yang telah diaktifkan. Plat dimasukkan kedalam bejana berisi pelarut yang telah dijenuhkan kemudian ditutup. Setelah dielusi, plat dikeluarkan dari bejana, dikeringkan dan hasilnya diperiksa dibawah sinar UV. Tiap zona diberi tanda dan digerus dari plat lalu dielusi dengan metanol 100%. Hasil elusi diuapkan hingga terbentuk kristal.

3.3.7 Uji Kemurnian Hasil Isolasi

3.3.7.1 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis

Dimasukkan fasa gerak n-heksana : etil asetat (60:40) v⁄_v dalam bejana kromatografi lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan dengan kloroform pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut kedalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas atas plat KLT lalu plat KLT dikeluarkan dari bejana kromatografi, dikeringkan dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl3 5%. Diamati warna noda yang dihasilkan dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan pada fasa gerak kloroform : metanol (90:10) v

v

⁄ dan benzene : eter (80:20) v

v

⁄.

3.3.7.2 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Penentuan Titik Lebur

Kristal hasil isolasi yang telah murni dimasukkan kedalam melting point apparatus lalu diamati pada suhu berapa kristal melebur.

3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi

3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible

Analisis dengan alat spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan menggunakan metanol sebagai pelarut.

3.3.8.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah (FT-IR)

Analisis dengan alat spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan menggunakan metanol sebagai pelarut.

3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (¹H-NMR)

Analisa dengan alat spektrometer ¹H-NMR diperoleh dari Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan menggunakan CDCl3 sebagai pelarut.