ISOLASI SENYAWA FLAVONOIDA DARI DAUN TUMBUHAN
BALIK ANGIN (Macaranga recurvata Gage.)
SKRIPSI
SONDANG ANGGERENY PAKPAHAN
080802014
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
ISOLASI SENYAWA FLAVONOIDA DARI DAUN TUMBUHAN
BALIK ANGIN (Macaranga recurvata Gage.)
SKRIPSI
Diajukan untuk melengkapi tugas dan memenuhi syarat mencapai gelar Sarjana Sains
SONDANG ANGGERENY PAKPAHAN
080802014
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
PERSETUJUAN
Judul : ISOLASI SENYAWA FLAVONOIDA DARI DAUN
TUMBUHAN BALIK ANGIN (Macaranga recurvata Gage.)
Kategori : SKRIPSI
Nama : SONDANG ANGGERENY PAKPAHAN
Nomor Induk mahasiswa : 080802014
Program studi : SARJANA (S1) KIMIA
Departemen : KIMIA
Fakultas : MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN
ALAM (FMIPA) UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
Disetujui di
Medan, Oktober 2012 Komisi Pembimbing :
Pembimbing 2 Pembimbing 1
Dr. Sovia Lenny, M.Si Lamek Marpaung M.Phil, Ph.D
NIP: 1975 1018 2000 032001 NIP: 1952 0828 1982 031001
Diketahui oleh
Departemen Kimia FMIPA USU Ketua,
PERNYATAAN
ISOLASI SENYAWA FLAVONOIDA DARI DAUN TUMBUHAN BALIK ANGIN (Macaranga recurvata Gage.)
SKRIPSI
Saya mengakui bahwa skripsi ini adalah hasil kerja saya sendiri, kecuali beberapa kutipan dan ringkasan yang masing – masing disebutkan sumbernya.
Medan, Oktober 2012
PENGHARGAAN
Puji dan syukur penulis ucapkan kepada Tuhan Yang Maha Pemurah dan Maha Pengasih atas segala penyertaanNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi ini.
Ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada Bapak Lamek Marpaung M.Phil, Ph.D dan Ibu Sovia Lenny M.Si selaku dosen pembimbing yang telah banyak memberi bimbingan, arahan, ilmu dan waktu selama penulis melakukan penelitian dan penyusunan skripsi ini sampai selesai. Ucapan terimakasih juga ditujukan kepada Ketua dan Sekertaris Departemen Kimia FMIPA USU, Ibu Dr. Rumondang Bulan Nst MS dan Bapak Drs Albert Pasaribu M.Sc, Bapak Jamahir Gultom Ph.D selaku dosen wali yang telah banyak memberi arahan dan masukan selama penulis kuliah, Bapak dan Ibu dosen bidang Kimia Bahan Alam serta seluruh dosen Departemen Kimia FMIPA USU. Terimakasih setulusnya penulis sampaikan kepada orang tua terkasih, ayahanda Alm. Pandapotan Pakpahan dan Ibunda Minar Hotmian Situmorang yang selalu memberi cinta, kasih sayang dan dukungan serta tak pernah lelah berdoa dan berjuang untuk selalu memberikan yang terbaik dalam kehidupan penulis. Secara khusus penulis menyampaikan terimakasih kepada opung tersayang, S.P Situmorang yang telah banyak memberi dukungan materi dan semangat pada penulis sampai terselesaikannya skripsi ini. Penulis juga mengucapkan terimakasih kepada adik-adik penulis, Febriany Pakpahan, Midian Pakpahan, Murni Pakpahan, Fajar Pakpahan, opung br Manullang serta seluruh keluarga besar yang selalu memotivasi dan mendukung penulis. Terimakasih juga penulis sampaikan kepada rekan-rekan asisten Kimia Bahan Alam FMIPA USU, sahabat-sahabat Micomie, teman-teman sesama penelitian dan teman-teman seperjuangan stambuk 2008 atas dukungan serta bantuan yang telah diberikan. Penulis juga mengucapkan terimakasih kepada seluruh teman, saudara dan kerabat yang telah banyak membantu dengan tulus namun namanya tak bisa dituliskan satu persatu.
ABSTRAK
Isolasi senyawa flavonoida yang terkandung di dalam daun tumbuhan balik angin (Macaranga recurvata Gage.) dilakukan dengan cara ekstraksi maserasi dengan menggunakan pelarut metanol. Ekstrak metanol dipekatkan lalu dilarutkan dengan etil asetat kemudian disaring diuapkan. Ektrak etil asetat dilarutkan dengan metanol dan diekstraksi partisi dengan n-heksana. Lapisan metanol diuapkan hingga pekat lalu dipisahkan dengan kromatografi kolom dengan fasa diam silika gel dan fasa gerak n-heksana:etil asetat dengan perbandingan (90:10) v v⁄, (80:20) v⁄v, (70:30) v v⁄ dan
(60:40) v v⁄. Fraksi dari perbandingan (60:40) v v⁄ dipisahkan dengan kromatografi
kolom II dengan fasa diam silika gel dan fasa gerak kloroform:metanol (90:10) v v⁄.
Senyawa yang diperoleh dihidrolisis kemudian dimurnikan menggunakan KLT preratatif. Senyawa murni yang diperoleh dari hasil isolasi yaitu kristal jarum, berwarna putih kekuningan dengan massa= 2,2 mg, titik lebur 138-140oC dan harga Rf= 0,45 diperoleh dengan menggunakan fasa gerak n-heksana:etil asetat (60:40) v v⁄.
ISOLATION OF FLAVONOID FROM THE LEAVES OF BALIK ANGIN (Macaranga recurvata Gage.)
ABTRACT
The isolation of flavonoid coumpound which contained in the leaves of balik angin (Macaranga recurvata Gage.) was done by maseration tehnique with methanol solvent. The methanol extract evaporated, dissolved with ethyl acetate solvent, concentrated and evaporated. Ethyl acetate extract was dissolve with methanol and partitioned with n-hexana solvent. Methanol layer was separated using coloumn Chromatography with silica gel as the stationary phase and n-hexane:ethyl acetate (90:10) v v⁄, (80:20) v⁄v, (70:30) v v⁄ and (60:40) v v⁄ as the mobile phase. The fraction
from n-hexane:aethyl acetate (60:40) v v⁄ was separated with second coloumn
DAFTAR ISI
2.1.1 Morfologi Tumbuhan Balik Angin 5
2.1.2 Sistematika Tumbuhan Balik Angin 5
2.1.3 Manfaat Tumbuhan Balik Angin 6
2.2Senyawa Flavonoida 6
2.2.1 Struktur Dasar Senyawa Flavonoida 8
2.2.2 Klasifikasi Senyawa Flavonoida 9
2.3.4 Kromatografi Kolom 17
2.3.5 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif 18
2.4Teknik Spektroskopi 19
2.4.1 Spektrofotometer Ultra-Violet (UV-Vis) 19
2.4.2 Spektrofotometer Inframerah (FT-IR) 21
2.4.3 Spektometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) 22
Bab 3 Metodologi Penelitian 23
3.3.1 Penyedian Sampel 24 3.3.2 Uji Pendahuluan terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan 25
Balik Angin
3.3.2.1 Skrining Fitokimia 25
3.3.2.2 Analisis Kromatografi Lapis Tipis 25 3.3.3 Prosedur Memperoleh Ekstrak Pekat metanol dari 26
Daun Tumbuhan Balik Angin (M. recurvata Gage.)
3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom 26
3.3.5 Pemutusan Gula dari Senyawa Flavonoida 27
3.3.6 Pemurnian dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif 28
3.3.7 Uji Kemurnian Hasil Isolasi 28
3.3.7.1 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi 28 Lapis Tipis
3.3.7.2 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Penentuan 29 Titik Lebur
3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi 29
3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrometer 29 Ultraviolet-Visibel (UV-Vis)
3.3.8.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer 29 Inframerah (FT-IR)
3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektometer Resonansi 30 Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
3.4Bagan Skrining Fitokimia 30
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran A. Determinasi Tumbuhan Balik Angin (M.recurvata Gage.) 44 Lampiran B. Gambar Tumbuhan Balik Angin (M.recurvata Gage.) 45 Lampiran C. Kromatogram Lapis Tipis Ekstrak Pekat Metanol Daun 46
Tumbuhan Balik Angin (M.recurvata Gage.) sebelum Kromatografi Kolom I
Lampiran D. Kromatogram Lapis Tipis Senyawa Hasil Pemisahan dengan 47 Kromatografi Kolom I sebelum Kromatografi Kolom II
Lampiran E. Kromatogram Lapis Tipis Ekstrak Kloroform Sebelum 48 KLT Preparatif
DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar 2.1Biosintesa hubungan antara jenis monomer flavonoida 7
dari alur asetat-malonat dan alur sikimat
Gambar 2.2 Kerangka Dasar Flavonoida 8
Gambar 4.1 Spektrum UV-Vis Senyawa Hasil Isolasi 33 Gambar 4.2 Spektrum FT-IR Senyawa Hasil Isolasi 34 Gambar 4.3 Spektrum 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi 35 Gambar 4.4 Ekspansi spektrum 1H-NMR senyawa Hasil Isolasi 36
(6,2 - 8,1 ppm)
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 2.1 Sifat golongan flavonoida 10
ABSTRAK
Isolasi senyawa flavonoida yang terkandung di dalam daun tumbuhan balik angin (Macaranga recurvata Gage.) dilakukan dengan cara ekstraksi maserasi dengan menggunakan pelarut metanol. Ekstrak metanol dipekatkan lalu dilarutkan dengan etil asetat kemudian disaring diuapkan. Ektrak etil asetat dilarutkan dengan metanol dan diekstraksi partisi dengan n-heksana. Lapisan metanol diuapkan hingga pekat lalu dipisahkan dengan kromatografi kolom dengan fasa diam silika gel dan fasa gerak n-heksana:etil asetat dengan perbandingan (90:10) v v⁄, (80:20) v⁄v, (70:30) v v⁄ dan
(60:40) v v⁄. Fraksi dari perbandingan (60:40) v v⁄ dipisahkan dengan kromatografi
kolom II dengan fasa diam silika gel dan fasa gerak kloroform:metanol (90:10) v v⁄.
Senyawa yang diperoleh dihidrolisis kemudian dimurnikan menggunakan KLT preratatif. Senyawa murni yang diperoleh dari hasil isolasi yaitu kristal jarum, berwarna putih kekuningan dengan massa= 2,2 mg, titik lebur 138-140oC dan harga Rf= 0,45 diperoleh dengan menggunakan fasa gerak n-heksana:etil asetat (60:40) v v⁄.
ISOLATION OF FLAVONOID FROM THE LEAVES OF BALIK ANGIN (Macaranga recurvata Gage.)
ABTRACT
The isolation of flavonoid coumpound which contained in the leaves of balik angin (Macaranga recurvata Gage.) was done by maseration tehnique with methanol solvent. The methanol extract evaporated, dissolved with ethyl acetate solvent, concentrated and evaporated. Ethyl acetate extract was dissolve with methanol and partitioned with n-hexana solvent. Methanol layer was separated using coloumn Chromatography with silica gel as the stationary phase and n-hexane:ethyl acetate (90:10) v v⁄, (80:20) v⁄v, (70:30) v v⁄ and (60:40) v v⁄ as the mobile phase. The fraction
from n-hexane:aethyl acetate (60:40) v v⁄ was separated with second coloumn
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Senyawa-senyawa flavonoida adalah senyawa-senyawa polifenol yang mempunyai 15 atom karbon, terdiri dari dua cincin benzena yang dihubungkan menjadi satu oleh rantai linier yang terdiri dari tiga atom karbon (Manito, 1981). Menurut perkiraan, kira-kira 2% dari seluruh karbon yang difotosintesis oleh tumbuhan diubah menjadi flavonoida atau senyawa yang berkaitan erat dengannya. Senyawa flavonoida terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, nektar, bunga, buah dan biji (Markham, 1988).
Secara biologis, flavonoida memainkan peranan penting dalam penyerbukan pada tanaman oleh serangga. Flavonoida memberikan kontribusi keindahan dan kesemarakan pada bunga dan buah-buahan di alam. Sejumlah flavonoida mempunyai rasa pahit hingga dapat bersifat menolak sejenis ulat tertentu (Sastrohamidjojo, 1996).
Dalam tubuh manusia, flavonoida berfungsi sebagai antioksidan sehingga sangat baik untuk pencegah kanker. Manfaat lain dari flavonoida antara lain untuk melindungi struktur sel, meningkatkan efektivitas vitamin C, anti inflamasi, mencegah keropos tulang dan sebagai antibiotik (Muhammad, 2011). Dalam dosis kecil flavon bekerja sebagai stimulan pada jantung, flavon terhidroksilasi bekerja sebagai diuretik dan sebagai antioksidan pada lemak (Sirait, 2007).
M.recurvata Gage merupakan jenis pohon teduhan. Biasanya ditemukan
ditempat-tempat terbuka di hutan primer dan tempat- tempat berawa. Dikoleksi pada ketinggian 500 m dibawah permukaan laut. Tumbuhan ini mempunyai tinggi kurang lebih 30 m. Memiliki ranting padat hingga berongga, daunnya berseling dan memerisai dengan panjang 21-55 cm dan lebar 13-44 cm (Anonim, 2012).
Penelitian fitokimia pernah dilakukan terhadap beberapa spesies macaranga. Beberapa senyawa yang pernah diisolasi dari genus macaranga (euphorbiaceae) adalah Chromenoflavones dari daun Macaranga Indica (Sultana, 1985), Prenylated flavonone dari daun Macaranga Pleiostemona sebagai antibakteri (Schutz,1995), Diterpenylated dan prenylated flavonoids dari Macaranga Denticulata sebagai antioksidan (Sutthivaiyaki, 2002).
Dari uji pendahuluan yang peneliti lakukan, yaitu dengan uji skrining fitokimia dengan pereaksi FeCl3 5%, NaOH 10%, Mg-HCl dan H2SO4(p) menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun tumbuhan balik angin mengandung senyawa flvonoida.
Dari uraian diatas dan beberapa literatur penelitian yang telah dilakukan terhadap beberapa spesies Macaranga maka peneliti tertarik untuk meneliti daun tumbuhan M.recurvata Gage yang merupakan salah satu spesies dari Genus Macaranga, khususnya mengenai senyawa flavonoida yang terkandung dalam tumbuhan ini.
1.2 Permasalahan
1.3 Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi senyawa flavonoida dan mengetahui golongan flavonoida dari daun tumbuhan Balik Angin (M.recurvata Gage.)
1.4 Manfaat Penelitian
Dari hasil penelitian diharapkan dapat memberikan sumber informasi ilmiah pada bidang Kimia Bahan Alam khususnya tentang senyawa flavonoida yang terkandung dalam daun tumbuhan Balik Angin (M.recurvata Gage.)
1.5 Lokasi Penelitian
1. Tempat pengambilan sampel
Sampel yang digunakan diperoleh dari daerah Sunggal Sumatera Utara. 2. Tempat melakukan penelitian
Penelitian dilakukan di laboratorium Kimia Bahan Alam FMIPA Universitas Sumatera Utara.
3. Lokasi Identifikasi Kristal Hasil Isolasi
Analisis spektrofotometer Inframerah (FT-IR), spektrofotometer Ultaviolet-Visibel (UV-Vis) dan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) dilakukan di Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang.
1.6 Metodologi Penelitian
flavonoida, yaitu dengan menggunakan pereaksi FeCl35%, NaOH 10%, Mg-HCl dan H2SO4(p).
Tahap isolasi yang dilakukan: 1. Ekstraksi Maserasi 2. Ekstraksi Partisi
3. Analisis Kromatografi Lapis Tipis 4. Analisis Kromatografi Kolom 5. Pemutusan Gula
6. Pemurnian dengan Kromatogarfi Lapis Tipis Preparatif 7. Analisis Senyawa Hasil Isolasi
Tahap analisis senyawa hasil isolasi yang dilakukan adalah: 1. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
2. Pengukuran Titik Lebur
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Tumbuhan Balik Angin
2.1.1 Morfologi Tumbuhan Balik Angin (Macaranga recurvata Gage.)
Balik angin (M.recurvata Gage.) merupakan jenis pohon teduhan, biasanya ditemui di tempat-tempat terbuka di hutan primer dan di tempat-tempat berawa. Tanaman ini biasanya ditemukan hingga ketinggian kurang lebih 500 m dpl. Tinggi pohon tanaman ini mencapai 45 meter, ranting padat hingga berongga, berwarna keputihan. Daun memerisai, panjang daun 21-55 cm, lebar daun 13-44 cm, pangkal daun membulat-melebar, tepi daun memiliki kelenjar, permukaan atas daun gundul, permukaan bawah daun gundul, keputihan, bertitik kelenjar rapat (Anonim, 2012).
2.1.2 Sistematika Tumbuhan Balik Angin (M. recurvata Gage.)
Sistematika tumbuhan balik angin adalah sebagai berikut: Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta Class : Dicotyledoneae
Ordo : Euphorbiales
Family : Euphorbiaceae
Genus : Macaranga
Tanaman ini dikoleksi hingga ketinggian kurang lebih 500 meter dibawah permukaan laut dan merupakan jenis pohon teduhan, biasanya tanaman ini ditemukan pada tempat-tempat terbuka di hutan primer dan di tempat-tempat berawa. Penyebaran tanaman ini di semenanjung Malaysia dan Borneo. Di Borneo jenis tanaman ini dikoleksi di daerah Serawak, Brunei, Sabah, Kalimantan Tengah dan Kalimantan Timur (Anonim, 2012).
2.1.3 Manfaat Tumbuhan Balik Angin (M. recurvata Gage.)
Daun dan kulit tumbuhan ini digunakan untuk pengobatan sakit perut, diare dan disentri (Burkill, 1935).
2.2 Senyawa Flavonoida
Senyawa flavonoida adalah senyawa-senyawa polifenol yang mempunyai 15 atom karbon, terdiri dari dua cincin benzena yang dihubungkan menjadi satu oleh rantai linear yang terdiri dari tiga atom karbon. Kerangka ini dapat ditullis sebagai C6 -C3-C6. Jadi senyawa flavonoida adalah senyawa 1,3 diarilpropana, senyawa isoflavonoida adalah senyawa 1,2 biarilpropana, sedang senyawa-senyawa neoflavonoida adalah senyawa 1,1 diarilpropana.
Istilah flavonoida dikenakan pada suatu golongan besar senyawa yang yang berasal dari kelompok senyawa yang paling umum yaitu flavon. Suatu jembatan oksigen terdapat diantara cincin A dalam kedudukan orto dan atom karbon benzil yang terletak di sebelah cincin B membentuk cincin baari tipe 4-piron. Senyawa heterosiklik ini pada tingkat oksidasi yang berbeda terdapat dalam kebanyakan tumbuhan. Flavon adalah bentuk yang mempunyai cincin C dengan tingkat
Menurut perkiraan, kira-kira 2% dari seluruh karbon yang difotosintesis oleh tumbuhan diubah menjadi flavonoida atau senyawa yang berkaitan erat dengannya. Flavonoida terdapat dalam semua tumbuhan hijau. Flavonoida terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, nektar, bunga, buah dan biji.
Semua varian flavonoida saling berkaitan karena alur biosintesis yang sama, yang memasukkan prazat dari alur sikimat dan asetat malonat. Flavonoida pertama dihasilkan segera setelah kedua alur tersebut bertemu. Flavonoida yang dianggap pertama kali terbentuk pada biosintesis adalah khalkkon dan semua bentuk lain diturunkan darinya melalui berbagai alur (Markham, 1988).
Dalam tubuh manusia, flavonoida berfungsi sebagai antioksidan sehingga sangat baik untuk pencegahan kanker. Manfaat lain lain flavonoida adalah melindungi struktur sel, meningkatkan efektivitas vitamin C, antiinflamasi, mencegah keropos tulang dan sebagai anti bioktik (Muhammad, 2011). Dalam dosis kecil flavon bekerja sebagai stimulan pada jantung, hesperidin mempengaruhi pembuluh darah kapiler, flavon terhidroksilasi bekerja sebagai diuretik dan antioksidan pada lemak. Kegunaan flavonoida pada tumbuhan adalah untuk menarik serangga yang membantu proses penyerbukan, membantu menarik perhatian binatang yang membantu penyebaran biji (Sirait, 2007).
2.2.1 Struktur Dasar Senyawa Flavonoida
Senyawa flavonoida adalah senyawa yang mengandung C15 terdiri atas dua inti fenolat yang dihubungkan dengan tiga satuan karbon. Struktur dasar flavonoida dapat digambarkan sebagai berikut:
C C C
A B
2.2.2 Klasifikasi Senyawa Flavonoida
Flavonoida biasanya terdapat sebagai flavonoida O-glikosida. Pada senyawa tersebut satu gugus hidroksil flavonoida atau lebih terikat pada satu gula atau lebih dengan ikatan hemimasetal yang tak tahan asam. Pengaruh glikosilasi menyebabkan flavonoida menjadi kurang reaktif dan lebih mudah larut dalam air. Glukosa merupakan gula yang paling umum terlibat walaupun galaktosa, ramnosa, xilosa dan arabinosa juga sering ditemukan.
Gula dapat juga terikat pada atom karbon flavonoida dan dalam hal ini gula tersebut terikat langsung pada inti benzena dengan suatu ikatan karbon-karbon yang tahan asam. Glikosida yang demikian disebut C-glikosida. Jenis gula yang terlibat lebih sedikit dibandingkan dengan gula pada O-glikosida.
Flavonoida sulfat adalah golongan flavonoida lain yang mudah larut dalam air. Senyawa ini mengandung satu ion sulfat atau lebih yang terikat pada hidroksi fenol atau gula. Secara teknis senyawa ini sebenarnya bisulfat karena terdapat sebagai garam yaitu flavon-O-SO3K. Banyak yang berupa glikosida bisulfat, bagian bisulfat terikat pada hidroksil fenol yang mana saja yang masih bebas atau pada suatu gula.
Biflavonoida merupakan flavonoida dimer. Flavonoida yang biasanya terlibat adalah flavon dan flavanon yang secara biosintesis mempunyai pola oksigenasi yang sederhana dan ikatan antar flavonoida berupa ikatan karbon-karbon atau ikatan eter. Monomer flavonoida yang digabungkan menjadi biflavonoida dapat berjenis sama atau berbeda, dan letak ikatannya berbeda-beda. Banyak sifat fisika dan kimia biflavnoida menyerupai sifat monoflavonoida pembentuknya dan akibatnya kadang-kadang biflavonoida sukar dikenali. Biflavonoida jarang ditemukan sebagai glikosida.
dihidroflavonol, katekin, pterokarpan, rotenoid dan beberapa biflavonoida (Markham, 1988).
Menurut Harbone (1996), dikenal sekitar sepuluh kelas flavonoida, dimana semua flavonoida menurut strukturnya merupakan turunan senyawa induk flavon dan memiliki sifat tertentu yaitu:
Tabel 2.1 Sifat golongan flavonoida Golongan
flavonoida
Penyebaran Ciri khas
Antosianin marak,dan biru juga dalam daun dan jaringan lain.
terutama tanwarna, dalam daun tumbuhan berkayu.
Terutamako-pigmen tanwarna dalam bunga sianik dan asianik tersebar luas dalam daun.
seperti flavonol
seperti flavonol
Larut dalam air, λmaks 515-545 nm, bergerak dengan BAA pada kertas.
menghasilkan antosianidin bila jaringan dipanaskan dalam HCl 2M selama setengah jam.
setelah hidrolisis, berupa bercak kuning murup pada kromatogram Forestal bila disinari sinar UV;
maksimal spektrum pada 330 – 350 nm.
setelah hidrolisis, berupa bercak coklat redup pada kromatogram Forestal; maksimal spektrum pada
330-350 nm.
Khalkon dan auron
Flavanon
Isoflavon
Pigmen bunga kuning,
kadang-kadang terdapat juga dalam jaringan lain
Tanwarna; dalam daun dan buah (terutama dalam Citrus)
Tanwarna; sering kali dalam akar; hanya terdapat dalam satu suku, Leguminosae
RF tinggi .
Dengan amonia berwarna merah (perubahan warna dapat diamati in situ), maksimal spektrum 370-410 nm.
Berwarna merah kuat dengan Mg/HCl; kadang – kadang sangat pahit .
bergerak pada kertas dengan pengembang air; tak ada uji warna yang khas.
Menurut Robinson (1995), flavonoida dapat dikelompokkan berdasarkan keragaman pada rantai C3 yaitu:
1. Flavonol
Flavonol sering terdapat sebagai glikosida, biasanya 3-glikosida dan aglikon flavonol yang umum yaitu kamferol, kuarsetin dan miresetin yang berkhasiat sebagai antioksidan dan antiinflamasi. Flavonol lain yang terdapat di alam bebas kebanyakan merupakan variasi struktur sederhana dari flavonol. Larutan flavonol dalam suasana basa dioksidasi oleh udara tetapi tidak begitu cepat sehingga penggunaan basa pada pengerjaannya masih dapat dilakukan.
O O
OH
2. Flavon
yang paling umum adalah 7-glukosida dan terdapat juga flavon yang terikat pada gula melalui ikatan karbon-karbon. Contohnya luteolin 8-C-glikosida. Flavon dianggap sebagai induk dalam nomenklatur kelompok senyawa flavonoida.
O O
3. Isoflavon
Isoflavon merupakan isomer flavon, tetapi jumlahnya sangat sedikit dan sebagai fitoaleksin yaitu senyawa pelindung yang terbentuk dalam tumbuhan sebagai pertahanan terhadap serangan penyakit. Isoflavon sukar dicirikan karena reaksinya tidak khas dengan pereaksi warna manapun. Beberapa isoflavon (misalnya daidzein) memberikan warna biru muda cemerlang dengan sinar UV bila diuapi amonia, tetapi kebanyakan yang lain tampak sebagai bercak lembayung yang pudar dengan amonia berubah menjadi coklat.
O O
4. Flavanon
Flavanon terdistribusi luas di alam. Flavanon terdapat di dalam kayu, daun dan bunga. Flavanon glikosida merupakan konstituen utama dari tanaman genus prenus dan buah jeruk, dua glikosida yang paling lazim adalah neringenin dan hesperitin, terdapat dalam buah anggur dan jeruk.
5. Flavanonol
Senyawa ini berkhasiat sebagai antioksidan dan hanya terdapat sedikit sekali jika dibandingkan dengan flavonoida lain. Sebagian besar senyawa ini diabaikan karena konsentrasinya rendah dan tidak berwarna.
O O
OH
6. Katekin
Katekin terdapat pada seluruh dunia tumbuhan, terutama pada tumbuhan berkayu. Senyawa ini mudah diperoleh dalam jumlah besar dari ekstrak kental Uncaria gambir dan daun teh kering yang mengandung kira-kira 30% senyawa ini. Katekin berkhasiat sebagai antioksidan.
Leukoantosianidin merupakan senyawa tanwarna, terutama terdapat pada tumbuhan berkayu. Senyawa ini jarang terdapat sebagai glikosida, contohnya melaksidin, apiferol.
O
OH
HO OH
8. Antosianidin
pigmen sianidin ini dengan penambahan atau pengurangan gugus hidroksil atau dengan metilasi atau glikosilasi.
O
OH
9. Khalkon
Khalkon adalah pigmen fenol kuning yang berwarna coklat tua dengan sinar Uv bila dikromatografi kertas. Aglikon khalkon dapat dibedakan dari glikosidanya karena hanya pigmen dalam bentuk glikosida yang dapat bergerak pada
kromatografi kertas dalam pengembang air.
O
10.Auron
Auron berupa pigmen kuning emas yang terdapat dalam bunga tertentu dan briofita. Dalam larutan basa senyawa ini berwarna ros dan tampak pada
kromatografi kertas berupa bercak kuning, dengan sinar ultraviolet warna kuning kuat berubah menjadi merah jungga bila diberi uap amonia (Robinson, 1995).
HC
O
O
2.2.3 Sifat Kelarutan Senyawa Flavonoida
flavonoida larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetilsulfoksida, dimetilformamida, air dan lain-lain. Adanya gula yang terikat pada flavonoida cenderung menyebabkan flavonoida lebih mudah larut dalam air. Dengan demikian campuran pelarut di atas dengan air merupakan pelarut yang lebih baik untuk glikosida. Sebaliknya, aglikon yang kurang polar seperti isoflavon, flavanon, flavon serta flavonol yang termetoksilasi cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform (Markham, 1988).
2.3 Teknik Pemisahan
2.3.1 Ekstraksi
Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan substansi atau zat dari campurannya dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Ekstraksi dapat digolongkan berdasarkan bentuk campuran yang diekstraksi dan proses pelaksanaannya. Berdasarkan bentuk campuran yang diekstraksi, suatu ekstraksi dibedakan menjadi:
1. Ekstraksi padat-cair
Zat yang diekstrasi terdapat di dalam campuran yang berbentuk padatan. Ekstraksi jenis ini banyak dilakukan di dalam usaha mengisolasi zat berkhasiat yang terkandung di dalam bahan alam.
2. Ekstraksi cair-cair
Zat yang diekstraksi terdapat di dalam campuran yang berbentuk cair. Ekstraksi cair-cair sering juga disebut ekstraksi pelarut untuk memisahkan logam-logam tertentu didalam air.
Menurut proses pelaksanaannya ekstraksi dibedakan menjadi: 1. Ekstraksi berkesinambungan (kontinyu)
2. Ekstraksi bertahap
Pada ekstraksi bertahap, setiap kali ekstraksi selalu digunakan pelarut yang baru sampai proses ekstraksi selesai. Alat yang biasanyadigunakan adalah corong pisah (Yazid, 2005).
2.3.2 Kromatografi
Kromatografi merupakan metode umum dalam pemisahan campuran berdasarkan fase diam dan fase gerak. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan dan fase diam berupa padatan atau lapisan cairan yang disokong oleh padatan. Fase gerak akan bergerak melewati fase diam dan senyawa-senyawa dalam campuran akan bergerak secara kontiniu diantara kedua fase sesuai dengan koefisien distribusi (Rodig, 1997).
Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya, kromatografi dapat dibedakan menjadi kromatografi adsorbsi, kromatografi partisi, kromatografi pasangan ion, kromatografi penukar ion dan kromatografi ekslusi ukuran. Berdasarkan pada alat yang diguanakan kromatografi dapat dibagi atas kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi cair kinerja tinggi, kromatografi gas dan kromaatografi kolom (Ganjar,2007).
2.3.2.1 Kromatografi Lapis Tipis
Teknik kromatografi lapis tipis sering dilakukan dengan menggunakan lempeng atau gelas plastik yang dilapisi fase diam dan fase geraknya merupakan pelarut. Campuaran yang akan dianalisis diteteskan pada dasar lempeng dan perlarutnya akan bergerak naik oleh gaya kapiler.
bergerak naik lebih jauh ke atas lempeng. Jarak tempuh ke atas lempeng merupakan cermin polaritas senyawa. Peningkatan polaritas pelarut akan menurunkan interaksi senyawa dengan fase diam sehingga senyawa dalam fase gerak bergerak lebih jauh pada lempeng (Bresnick, 2005).
Fase diam yang digunakan pada kromatografi lapis tipis merupakan penyerap berukuran kecil dengan diameter partikel 10-30 μm. Semakin kecil ukuran rata -rata partikel fase diam maka semakin baik kinerja kromatografi lapis tipis dalam hal efesiensi dan resolusi (Ganjar, 2007).
Nilai utama kromatografi lapis tipis pada penelitian flavonoida adalah sebagai cara analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit. Menurut Markham, Kromatografi Lapis Tipis terutama berguna untuk tujuan berikut:
1. Mencari pelarut untuk kromatografi kolom
2. Analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom 3. Identifikasi flavonoida secara ko-kromatografi
4. Isolasi flavonoida murni skala kecil
5. Penyerap dan pengembang yang digunakan umumnya sama dengan penyerap dan pengembang pada kromatografi kolom dan kromatografi kertas (Markham, 1988).
Faktor reterdasi merupakan parameter karakteristik kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis. Harga Rf adalah ukuran kecepatan migrasi suatu komponen pada kromatogram. Rf didefenisikan sebagai perrbandingan jarak yang ditempuh komponen terhadap jarak yang ditempuh pelarut atau fase gerak.
�� = jarak yang ditempuh komponen jarak yang ditempuh pelarut
(Yazid, 2005)
2.3.2.2 Kromatografi Kolom
dengan jumlah senyawa yang akan akan dianalisis (Bintang, 2011). Pada kromatografi kolom fase diam dan zat cair ditempatkan didalam tabung kaca berbentuk silinder, pada bagian bawah tertutup dengan katup atau keran dan fase geraknya dibiarkan mengalir ke bawah malalui gaya berat.
Kromatografi kolom biasanya dibuat dengan menuangkan suspensi fasa diam dan pelarut yang sesuai kedalam kolom dan dibiarkan memadat. Selanjutnya pelarut diturunkan sampai tepat pada bagian atas penyerap dan cuplikan yang akan dipisahkan diletakkan pada bagian atas penyerap kemudian fase gerak dimasukkan dan dibiarkan mengalir melewati kolom dan komponen campuran turun berupa pita dengan laju yang berlainan kemudian hasil pemisahan dari kolom dikumpulkan sebagai fraksi. Kromatografi kolom merupakan bentuk kromatografi cair (Gritter, 1991).
2.3.2.3 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Metode kromatografi juga dapat dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis preparatif yaitu pemisahan yang terdiri atas sejumlah senyawa serupa dengan kromatografi jenis yang sukar dan kadang-kadang lama dipisahkan. KLT preparatif adalah cara ideal untuk memisahkan cuplikan kecil (50 mg sampai 1 g). Penyerap yang dipakai adalah silika gel dan dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun campuran senyawa hidrofil. Ketebalan adsorben yang sering dipakai 0,5 – 2 mm. Ukuran plat kromatografi biasanya 20x20 cm atau 20x40 cm.
dengan logam tipis atau kertas lilin. Penyerap diletakkan dalam corong kaca memakai kertas saring lalu dielusi beberapa kali dengan pelarut yang cocok (Gritter, 1991).
2.4. Teknik Spektroskopi
Teknik spektroskopi adalah salah satu teknik analisis kimia-fisika yang mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik. Ada dua macam instrumen pada teknik spektroskopik yaitu spektrometer dan spektrofotometer. Instrumen yang memakai monokromator celah yang tetap pada bidang fokus disebut spektrometer. Apabila spektrometer tersebut dilengkapi dengan detektor yang bersifat fotoelektrik disebut sebagai spektrofotometer (Muldja, 1995).
Panjang gelombang pada suatu senyawa organik yang menyerap energi cahaya bergantung pada struktur senyawa itu. Oleh karena itu teknik spektroskopi dapat digunakan untuk menentukan struktur senyawaan yang tidak diketahui dan untuk mempelajari karakteristik ikatan dari senyawaan yang diketahui (fessenden, 1983).
Rumus molekul dapat ditentukan dari spektrum massa dan bentuk fragmentasinya. Gugus fungsi alami ditentukan dari spektrum inframerah. Gugus fungsi terkonjugasi dapat ditentukan dari spektrum elektronik. Struktur dapat ditentukan berdasarkan inti proton dan karbon yang dihasilkan molekul dari spektrum 1H dan 13C NMR (Brown,1937).
2.4.1 Spektrofotometer Ultraviolet-Visibel (UV-Vis)
dikenakan radiasi elektromagnetik akan mengabsopsi radiasi elektromagnetik yang energinya sesuai. Interaksi tersebuat akan meningkatkan energi potensial elektron pada tingkat keadaan eksitasi. Apabila pada molekul sederhana tersebut hanya terjadi transisi elektronik pada satu macam gugus maka akan terjadi suatu absorpsi yang merupakan garis spektrum (Muldja,1995).
Flavonoida mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi karena itu memiliki menunjukkan pita serapan kuat pada daerah spektrum ultraviolet dan spektrum tampak (Harbone, 1987). Spektrum flavonoida biasanya ditentukan dalam larutan dengan pelarut metanol atau etanol. Spektrum khas terdiri atas dua maksima pada rentang 240-285 nm (pita II) dan 300-550 nm (pita I). Kedudukan yang tepat dan kekuatan nisbi maksima terssebut memberika informasi yang berharga mengenai sifat dan pola oksigenasinya. Ciri khas spektrum adalah kekuatan nisbi yang rendah pada pita I dalam dhidroflavon,dihidroflavonol dan isoflavon serta kedudukan pita I pada spektrum khalkon, auron dan antosianin yang terdapat pada panjang gelombang yang tinggi. petunjuk mengenai rentang maksima utama yang diperkirakan untuk setiap jenis flavonoida adalah sebagai berikut:
2.4.2 Spektrofotometer Infra Merah (FT-IR)
Cahaya tampak terdiri dari beberapa range frekuensi elektomagnetik yang berbeda dimana setiap frekuensi bisa dilihat sebagai warna yang berebeda. Radiasi inframerah juga mengandung beberapa range frekuensi tetapi tidak dapat dilihat oleh mata. Pengukuran pada spektrum inframerah dilakukan pada daerah cahaya inframerah tengah yaitu pada panjang gelombang 2,5-50 μm atau bilangan gelombang 4000-200 cm-1. Energi yang dihasilkan oleh radiasi ini akan menyebabkan vibrasi atau getaran pada molekul. Pita absorbsi inframerah sangat khas dan spesifik untuk setiap tipe ikatan kimia atau gugus fungsi.
Jika suatu frekuensi tertentu dari radiasi inframerah dilewatkan pada suatu sampel senyawa organik maka akan terjadi penyerapan frekunsi oleh senyawa tersebut. Detektor akan mendeteksi frekuensi yang dilewatkan pada sampel yang tidak diserap oleh senyawa. Banyaknya frekuensi yang melewati senyawa atau yang tidak diserap akan diukur sebagai persen transmitan. Spektrum yang dihasilkan berupa grafik yang akan menunjukkan persentase transmitan yang bervariasi pada setiap frekuensi radiasi inframerah. Satuan frekunsi yang digunakan dinyatakan dalam bilangan gelombang (Dachriyanus, 2004).
Terdapat dua macam getaran molekul, yaitu getaran ulur dan getaran tekuk. Getaran ulur adalah suatu gerakan berirama di sepanjang sumbu ikatan sehingga jarak antar atom bertambah atau berkurang. Getaran tekuk dapat terjadi karena perubahan sudut-sudut ikatan antara ikatan-ikatan pada sebuah atom atau karena gerakan sebuah gugusan atom terhadap sisa molekul tanpa gerakan nisbi atom-atom dalam gugusan (Silverstein, 1986). Instrumen yang digunakan untuk mengukur resapan radiasi inframerah pada berbagai macam panjang gelombang disebut spektrofotometer inframerah (Fessenden, 1982). Spektrofotometer inframerah pada umumnya digunakan untuk:
1. Menentukan gugus fungsi suatu senyawa organik
2.4.3 Spektrometer Resonansi Magnetik Inti proton (1H-NMR)
Spektrometer Resonansi Magnetik Inti (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) merupakan alat yang berguna pada penentuan struktur molekul organik. Teknik ini memberikan informasi mengenai berbagai jenis atom hidrogen dalam molekul. Spektrum Resonansi Magnetik Inti memberikan informasi mengenai lingkungan kimia atom hidrogen, jumlah atom hidrogen dalam setiap lingkungan dan struktur gugusan yang berdekatan dengan setiap atom hidrogen (Creswell, 1982).
Spektrum Resonansi Mangeti Inti pada umunya digunakan untuk:
1. Menentukan jumlah proton yang memiliki lingkungan kimia yang sama pada suatu senyawa organik
2. Mengetahui informasi mengenai struktur suatu senyawa organik (Dachriyanus, 2004).
Terperisai dan tak terperisai merupakan istilah relatif. Untuk memperoleh pengukuran yang kuantitatif diperlukan suatu titik rujukan. Senyawa yang dipilih untuk rujukan adalah Tetrametilsilana (CH3)4Si, yang proton-protonnya menyerap pada ujung kanan spektrum NMR (Fessenden, 1982). Pada beberapa spektrum NMR akan terlihat sinyal TMS pada angka nol sehingga sinyal ini tidak perlu dianalisa. TMS dipilih sebagai standart karena:
1. TMS mempunyai 12 atom hidrogen yang keseluruhannya mempunyai lingkungan kimia yang sama, sehingga menghasilkan sinyal singlet yang kuat karena mengandung banyak atom hidrogen
2. Elektron-elektron pada ikatan C-H dalam senyawa ini berada dekat dengan hidrogen jia dibanding dengan senyawa lain. Ini berarti inti hidrogen sangat terlindungi dari medan magneteksternal sehingga dibutuhkan medan magnet yang besar untuk membawa atom hidrogen ke kondisi resonansi (Dachriyanus, 2004).
BAB 3
6. Ekstraktor 5000 mL Schoot/ Duran
7. Tabung reaksi Pyrex
8. Pipet tetes 9. Pipa kapiler 10.Spatula
11.Rotarievaporator Bűchi R-114
12.Labu rotarievaporator 1000 mL
13.Labu didih 1000 mL Schoot/ Duran
14.Labu takar 250 mL Pyrex
15.Kolom kromatografi Pyrex
16.Botol vial
17.Neraca analitis Mettler AE 200
18.Lampu UV 254 nm/ 356 nm UVGL 58
19.Statif dan klem 20.Penangas air 21.Alat destilasi 22.Bunsen
23.Bejana Kromatografi Lapis Tipis
24.Bejana Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
26.Spektrofotometer UV-Visible
27.Spektrometer 1H-NMR Jeol/Delta2NMR 500MHz
3.2 Bahan-bahan
1. Daun tumbuhan Balik Angin (M.recurvata Gage.)
2. Metanol Destilasai
3. N-heksana Teknis
4. Etil asetat Teknis
5. Aquadest
6. Kloroforom Teknis
7. Benzena p. a. E. Merck
8. Eter p. a. E. Merck
9. Silika gel 40 (70-230 mesh) ASTM E.Merck. KGaA 10.FeCl3 5%
11.NaOH 10 % 12.Mg-HCl 13.H2SO4(P) 14.HCl 2N
15.Plat KLT Merck/ Kieselgel 60 F254
16.Plat KLT Preparatif Merck/ Kieselgel 60 F254
17.Pereaksi Benedict
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan Sampel
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Balik Angin
Serbuk daun tumbuhan balik angin diidentifikasikan dengan menggunakan cara: 1. Skrining Fitokimia
2. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
3.3.2.1Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada daun tumbuhan balik angin maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut:
- Dimasukkan ± 10 gram serbuk daun tumbuhan balik angin (M.recurvata Gage.) yang telah dikeringkan dan dipotong kecil-kecil ke dalam erlenmeyer - Ditambahkan metanol ± 100 mL
- Didiamkan - Disaring
- Dibagi ekstrak metanol kedalam 4 tabung reaksi - Ditambahkan masing-masing pereaksi:
a. Tabung I : dengan FeCl3 5% menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda c. Tabung III : dengan NaOH 10% menghasilkan larutan biru violet
d. Tabung IV : dengan H2SO4(p) menghasilkan larutan orange kekuningan
3.3.2.2 Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F254 Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan adalah campuran n-heksana:etil asetat. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-heksana:etil asetat dengan perbandingan (90:10) v v⁄ ,
Dimasukkan 10 mL larutan fase gerak n-heksana:etil asetat (90:10) v⁄v
kedalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat kedalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi FeCl3 5%. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksan: etil asetat dengan perbandingan (80:20) v v⁄ , (70:30) v v⁄ dan (60:40) v⁄v.
3.3.3 Memperoleh Ekstrak Pekat Metanol dari Daun Tumbuhan Balik Angin (M.recurvata Gage.)
Serbuk daun tumbuhan balik angin ditimbang sebanyak 1400 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 3 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama ± 48 jam dan diulangi sebanyak 4 kali. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut menguap. Lalu dilakukan pemblokan tanin dengan cara melarutkan fraksi metanol dengan etil asetat dan disaring. Filtrat kemuadian dirotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi etil asetat dilarutkan dengan metanol dan dipartisi berulang-ulang dengan n-heksana. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana lalu diuapkan hingga pekat sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol sebanyak 12,06 g.
3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Kolom I :
Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan 370 g silika gel dengan menggunakan n-heksana, diaduk hingga homogen lalu dimasukkan kedalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100% hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 12,06 g ekstrak pekat metanol daun tumbuhan balik angin kedalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat (90:10)v
v
⁄ secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fase gerak n-heksana : etil asetat dengan perbandingan (80:20) v
⁄. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 12 mL lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama.
Kolom II:
Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan 70 g silika gel dengan menggunakan kloroform, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan kedalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan kloroform 100% hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 2,48 g fraksi hasil penggabungan kolom I kedalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel lalu ditambahkan fasa gerak kloroform : metanol (90:10) v⁄v secara
perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial sebanyak 5 mL lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama. Diuapkan sampai terbentuk kristal.
3.3.5 Pemutusan Gula dari Senyawa Flavonoida
Senyawa yang diperoleh dari kolom kromatografi dilarutkan dengan metanol kemudian dihidrolisa dengan menggunakan HCl 2N lalu dipanaskan selama ± 45 menit dan disaring. Filtrat yang diperoleh diekstraksi partisi dengan kloroform secara berulang-ulang. Lapisan kloroform diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 0,17 g.
3.3.6 Pemurnian dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Pemurnian senyawa flvonoida dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif dilakukan karena hasil analis KLT dari kristal yang diperoleh dengan kromatografi kolom menunjukkan hasil yang belum murni.
Ekstrak pekat kloroform dilarutkan kembali dengan kloroform lalu dianalisis KLT untuk mengetahui apakah senyawa yang diperoleh sudah murni atau belum sekaligus mencari fasa gerak yang sesuai untuk Kromatomatografi Lapis Tipis Preparatif. Benzene : eter (80:20) v⁄v adalah fasa gerak yang menunjukkan
pemisahan paling baik untuk selanjutnya digunakan untuk menjenuhkan bejana KLT preparatif. Selanjutnya kristal yang telah dilarutkan tadi ditotolkan secara perlahan-lahan dan sama rata disepanjang tepi bawah plat KLT yang telah diaktifkan. Plat dimasukkan kedalam bejana berisi pelarut yang telah dijenuhkan kemudian ditutup. Setelah dielusi, plat dikeluarkan dari bejana, dikeringkan dan hasilnya diperiksa dibawah sinar UV. Tiap zona diberi tanda dan digerus dari plat lalu dielusi dengan metanol 100%. Hasil elusi diuapkan hingga terbentuk kristal.
3.3.7 Uji Kemurnian Hasil Isolasi
3.3.7.1 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis
Dimasukkan fasa gerak n-heksana : etil asetat (60:40) v⁄v dalam bejana
kromatografi lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan dengan kloroform pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut kedalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas atas plat KLT lalu plat KLT dikeluarkan dari bejana kromatografi, dikeringkan dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl3 5%. Diamati warna noda yang dihasilkan dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan pada fasa gerak kloroform : metanol (90:10) v
v
⁄ dan benzene : eter (80:20) v
v
⁄.
3.3.7.2 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Penentuan Titik Lebur
Kristal hasil isolasi yang telah murni dimasukkan kedalam melting point apparatus lalu diamati pada suhu berapa kristal melebur.
3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis dengan alat spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan menggunakan metanol sebagai pelarut.
3.3.8.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah (FT-IR)
3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
Analisa dengan alat spektrometer 1H-NMR diperoleh dari Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan menggunakan CDCl3 sebagai pelarut.
3.4 Bagan Skrining Fitokimia
Serbuk daun tumbuhan balik angin
(
Macaranga recurvata
Gage.)
diekstraksi maserasi dengan metanol
disaring
dipekatkan
dibagi kedalam 4 tabung reaksi
3.5 Bagan Penelitian
1400 g serbuk daun tumbuhan balik angin (Macaranga recurvata Gage.)
diskrining fitokimima
diekstraksi maserasi dengan metanol selama ± 48 jam dilakukan sebanyak 4 kali
diuapkan hingga semua metanol menguap dipekatkan dengan rotarievaporator
diuapkan hingga semua etil asetat menguap dilarutkan dengan metanol
diekstraksi partisi dengan n-heksana sampai bening
lapisan metanol
diskrining fitokimia diuapkan hingga pekat ekstrak pekat metanol
lapisan n-heksana
diuji KLT untuk mengetahui eluen yang sesuai pada kromatografi kolom
dikolom kromatografi dengan fase diam silika gel dan fase gerak (eluen) n-heksana : etil asetat dengan perbandingan (90:10)v/
v, (80:20) v/v, (70:30) v/v dan (60:40)v/v
ditampung tiap fraksi dalam botol vial 12 mL dihitung harga Rf
digabung fraksi dengan harga Rf yang sama
fraksi 1-51
diuji KLT untuk mengetahui eluen yang sesuai pada kromatografi kolom
dikolom kromatografi dengan fase diam silika gel dan fase gerak (eluen) kloroform : metanol (90 : 10) v/v
ditampung tiap fraksi dalam botol vial 5 mL
dihitung harga Rf
Sambungan Bagan Penelitian
fraksi 1-8 fraksi 9-14 fraksi 15-37 fraksi 38-123 diuji hasil negatif hasil positif hasil positif hasil positif
dilakukan uji kandungan gula dengan pereaksi benedict (+)
dilarutkan dengan metanol
dihidrolisa dengan menggunakan HCl 2N sambil dipanaskan selama ± 45 menit didinginkan
diuapkan hingga seluruh kloroform menguap ekstrak pekat kloroform
dianalisis Kromatografi Lapis Tipis
dikromatografi Lapis Tipis Preparatif dengan eluen benzene:eter (80:20) v/ v
dikeringkan
digerus dari plat dan dilarutkan dengan metanol disaring
senyawa murni diuapkan
dianalisis Kromatografi Lapis Tipis diuji titik lebur
dianalisis dengan spektrofotometer UV-Visible, spektrofotometer inframerah dan spektrometer 1H-NMR
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1.Hasil Penelitian
Hasil skrining fitokimia terhadap ekstrak metanol dari daun tumbuhan balik angin (M.recurvata Gage.) menunjukkan bahwa sampel positif terhadap pereaksi-pereaksi flavonoida. Hasil isolasi senyawa flavonoida dari daun tumbuhan balik angin yaitu berupa kristal jarum, berwarna putih kekuningan dengan massa= 2,2 mg, titik lebur 138-141 OC dan harga Rf= 0,42 diperoleh dengan fase gerak n-heksana : etil asetat (60:40) v⁄v, positif terhadap pereaksi flavonoida.
Spektrum UV-Visibel senyawa hasil isolasi ditunjukkan pada gambar 4.1 dibawah ini:
Gambar 4.1 Spektrum UV-Vis Senyawa Hasil Isolasi
Hasil analisis Spektrofotometer Ultraviolet-Visible (UV-Vis) dengan pelarut metanol memberikan panjang gelombang maksimum (λmaks) sebagai berikut: 1. Pada pita I memberikan panjang gelombang 339,5 nm
Spektrum FT-IR senyawa hasil isolaasi dapat dilihat pada gambar 4.2 dibawah
Gambar 4.2 Spektrum FT-IR Senyawa Hasil Isolasi
Hasil analisis spektofotometer FT-IR pada senyawa hasil isolasi menghasilkan pita serapan pada daerah gelombang sebagai berikut:
1. Pada bilangan gelombang 3338,78-3271,27 cm-1 puncak tajam menunjukkan adanya vibrasi ulur –OH
2. Pada bilangan gelombang 3107,32-3028,24 cm-1 puncak tajam menunjukkan adanya vibrasi ulur –CH aromatik
3. Pada bilangan gelombang 2920,23-2850,79 cm-1 puncak tajam menunjukkan adanya vibrasi ulur –CH alifatik
4. Pada bilangan gelombang 1707,00 cm-1 puncak tajam menunjukkan adanya vibrasi ulur ikatan rangkap C=O dari keton
6. Pada bilangan gelombang 1375,25 cm-1 menunjukkan adanya vibrasi tekuk dari CH3
7. Pada bilangan gelombang 1292,31 cm-1 menunjukkan adanya vibrasi ulur dari C-O dari gugus alkohol
8. Pada bilangan gelombang 1190,08 cm-1 menunjukkan adanya vibrasi ulur dari C-CO-C dari gugus keton
9. Pada bilangan gelombang 1141,86 cm-1 menunjukkan adanya vibrasi ulur C-O-C asimetris
10.Pada bilangan gelombang 1018,41 cm-1 menunjukkan adanya vibrasi ulur C-O-C simetris
11.Pada bilangan gelombang 921, 97 – 663,51 cm-1 menunjukkan adanya vibrasi tekuk dari C-H aromatik (Silverstein, 1986).
Gambar 4.3 Spektrum 1H-NMR senyawa Hasil Isolasi
Gambar 4.4 Ekspansi spektrum 1H-NMR senyawa Hasil Isolasi (6,2 - 8,1 ppm)
Hasil analisa Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) senyawa hasil Isolasi dengan menggunakan pelarut CDCl3memberikan pergeseran kimia (ppm) sebagai berikut:
1. Pergeseran kimia pada daerah δ= 1,3253 ppm puncak singlet menunjukkan proton-proton dari gugus metil (-CH3) pada C-3 dari cincin C struktur flavonoida.
2. Pergeseran kimia pada daerah δ= 3,9429 ppm puncak singlet menunjukkan proton-proton dari gugus metoksi (-OCH3) pada C-6 dari cincin A struktur flavonoida.
4. Pergeseran kimia pada daerah δ= 6,8458 ppm puncak singlet menunjukkan proton pada H-8 pada cincin A struktur flavonoida.
5. Pergeseran kimia pada daerah δ= 6,9210 ppm puncak singlet menunjukkan proton pada H-5 pada cincin A struktur flavonoida.
6. Pergeseran kimia pada daerah δ= 7,5916-7,6098 puncak doublet menunjukkan proton-proton pada H-2’ dan H-6’ pada cincin B struktur flavonoida.
4.2.Pembahasan
Dari hasil kromatografi lapis tipis, diketahui bahwa perbandingan pelarut yang baik untuk mengisolasi senyawa flavonoida dari daun tumbuhan balik angin adalah n-heksana:etil asetat (60:40) v
v
⁄ yang menunjukkan pemisahan yang lebih baik dari noda yang dihasilkan (Lampiran C). Selanjutnya dilakukan ekstraski maserasi terhadap daun tumbuhan balik angin (M.recurvata Gage.) sehingga dihasilkan ekstrak pekat metanol kemudian dipisahkan dengan kromatografi kolom. Fraksi dari kromatografi kolom kemudian di uji KLT untuk mengetahui kemurnian dan harga Rf yang sama. Fraksi dari kromatografi kolom I kemudian digabungkan dan diuji KLT untuk mengetahui eluen yang sesuai untuk kolom kromatografi II (Lampiran D).Fraksi hasil penggabungan dari kromatografi kolom II kemudian dihidrolisa dengan HCl 2N dan dipartisi dengan kloroform lalu diuapkan sehingga dihasilkan ekstrak pekat kloroform. Ekstrak pekat kloroform kemudian di uji KLT untuk mengetahui eluen yang sesuai untuk pemurnian dengan kromatografi lapis tipis preparatif (Lampiran E).Senyawa yang diperoleh kemurniannya diuji KLT dengan eluen n-heksan : etil asetat (60:40) v v⁄, benzena :
eter (80:20) v v⁄ dan kloroform:metanol (90:10) v⁄v yang menunjukkan hanya satu
noda pada senyawa yang dihasilkan (Lampiran F).
Hasil interpretasi Spektrum Inframerah (FT-IR) dan Spektrum Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut CDCl3 dalam stsndar TMS diperoleh:
1. Pergeseran kimia pada daerah δ= 1,2488 ppm dengan puncak singlet menunjukkan proton dari gugus metil (-CH3) pada C-3 dari cincin C senyawa flavonoida. Hal ini didukung oleh spektrum infra merah pada bilangan gelombang 2920,23-2850,79 cm-1 dengan puncak tajam adanya vibrasi ulur C-H alifatik dan pada bilangan gelombang 1375,25 cm-1 dengan puncak tajam menunjukkan adanya vibrasi tekuk CH3.
2. Pergeseran kimia pada daerah δ= 3,9429 ppm dengan puncak singlet menunjukkan proton dari gugus metoksi (-OCH3) pada C-6 dari cincin A senyawa flavonoida. Hal ini didukung oleh spektrum infra merah pada bilangan gelombang 2920,23-2850,79 cm-1 dengan puncak tajam menunjukkan adanya vibrasi ulur C-H alifatik dan spektrum pada bilangan gelombang 1375,25 cm-1 dengan puncak tajam menunjukkan adanya vibrasi tekuk CH3. Hal ini didukung juga oleh spektrum pada bilangan gelombang 1141,86 cm-1 menunjukkan adanya vibrasi ulur C-O-C asimetrik.
3. Pergeseran kimia pada daerah δ= 6,2634-6,2828 ppm puncak doublet menunjukkan proton pada H-3’ dan H-5’ pada cincin A. Hal ini didukung oleh spektrum inframerah pada bilangan gelombang 3107,32-3028,24 cm-1 puncak tajam menunjukkan adanya vibrasi ulur C-H aromatik dan pada bilangan gelombang 1627,92 - 1514,12 cm-1 puncak tajam menunjukkan adanya vibrasi ulur C=C pada cincin aromatik. Hal ini didukung juga oleh spektrum inframerah pada bilangan gelombang 921,97 – 663,51 cm-1 yang menunjukkan adanya vibrasi tekuk C-H pada cincin aromatik.
4. Pergeseran kimia pada daerah δ= 6,8458 ppm puncak singlet menunjukkan proton pada H-8 pada cincin A struktur flavonoida. Hal ini didukung oleh spektrum inframerah pada bilangan gelombang 3107,32-3028,24 cm-1 puncak tajam menunjukkan adanya vibrasi ulur C-H aromatik dan pada bilangan gelombang 1627,92 - 1514,12 cm-1 puncak tajam mennjukkan adanya vibrasi ulur C=C pada cincin aromatik. Hal ini didukung juga oleh spektrum
5. Pergeseran kimia pada daerah δ= 6,9210 ppm puncak singlet menunjukkan proton pada H-5 pada cincin A struktur flavonoida. Hal ini didukung oleh spektrum inframerah pada bilangan gelombang 3107,32-3028,24 cm-1 puncak tajam menunjukkan adanya vibrasi C-H aromatik dan pada bilangan gelombang 1627,92 - 1514,12 cm-1 puncak tajam menunjukkan adanya vibrasi C=C pada cincin aromatik. Hal ini didukung juga oleh spektrum inframerah pada bilangan gelombang 921,97 – 663,51cm-1 yang menunjukkan adanya vibrasi tekuk C-H pada cincin aromatik.
6. Pergeseran kimia pada daerah δ= 7,5916-7,6098 puncak doublet menunjukkan proton-proton pada H-2’ dan H-6’ pada cincin B struktur flavonoida. Hal ini didukung oleh spektrum inframerah pada bilangan gelombang 3107,32-3028,24 cm-1 puncak tajam menunjukkan adanya vibrasi ulur CH aromatik dan pada bilangan gelombang 1627,92 - 1514,12 cm-1 puncak tajam mennjukkan adanya vibrasi C=C pada cincin aromatik. Hal ini didukung juga oleh spektrum inframerah pada bilangan gelombang 921,97 – 663,51 cm-1 yang menunjukkan adanya vibrasi tekuk C-H pada cincin aromatik.
Dari hasil pembahasan diatas, berdasarkan skrining fitokimia, data spektrum UV-Vis, data spektrum inframerah dan 1H-NMR dapat diduga bahwa senyawa yang diisolasi dari daun tumbuhan balik angin (M.recurvata Gage.) merupakan senyawa flavonoida golongan flavon dengan kerangka sebagai berikut:
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1.Kesimpulan
1. Hasil uji skrining fitokimia dengan pereaksi flavonoida menunjukkan bahwa daun tumbuhan balik angin (M.recurvata Gage.) mengandung senyawa flavonoida.
2. Hasil isolasi senyawa flavonoida dari daun tumbuhan balik angin yaitu berupa kristal jarum, berwarna putih kekuningan dengan massa= 2,2 mg, titik lebur 138-141 OC dan harga Rf= 0,42 diperoleh dengan fase gerak n-heksan:etil asetat (60:40) v
v
⁄, positif terhadap pereaksi flavonoida.
3. Hasil analisis dengan spektrofotometer inframerah (FT-IR), spektrofotometer Ultraviolet-Visible (UV-Vis) dan spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi dari daun tumbuhan balik angin (M.recurvata Gage.) diduga adalah senyawa flavonoida golongan flavon.
5.2.Saran
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2012. http://www.nationaalherbarium.nl /macmalborneo/Macaranga %20recurvata.htm
Bintang, M. 2011. Biokimia Teknik Penelitian. Bogor: Erlangga Bresnick, S. 2003. Intisari Kimia Organik. Jakarta: Erlangga
Brown,D.W. 1988. Organic Spectroscopy. New Delhi: Thomson Press.
Burkill, I.H. 1935. A Dictionary of The Economic Product of Malay Peninsula. London: Millbank. Vol II
Cresswell, C.J, dkk. 1982. Analisis Spektrum Senyawa Organik. Edisi kedua. Bandung: Penerbit ITB.
Dachriyanus. 2004. Analisis Struktur Senyawa Organik secara Spektroskopi. Padang: Andalas University Press.
Fessenden, R.J. 1982. Kimia Organik. Jilid I. Cetakan Kedua. Terjemahan Aloysius Pudjaatmaka. Jakarta: Erlangga.
Ganjar, J. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Cetakan Pertama. Yogyakarta: Pustaka Pelajar.
Gritter, R. J. 1991. Pengantar Kromatografi. Terbitan ke-2. Terjemahan Kosasih Padmawinata. Bandung: Penerbit ITB.
Harborne, J. B. 1987. Metoda Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisa Tumbuhan. Terbitan ke-2. Terjemahan Kosasih Padmawinata dan Iwang
Soediro. Bandung: Penerbit ITB.
Markham, K. R. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoida. Terjemahan Kosasih Padmawinata. Bandung: ITB Press.
Muhammad,A. 2011. Sarang Semut dan Buah Merah Pembasmi Ragam Penyakit Ganas. Cetakan Pertama. Jogjakarta: Laksana
Muldja, M.H. 1995. Analisis Instrumental. Cetakan Pertama. Surabaya: Universitas Airlangga Press.
Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Terjemahan Padmawinata. Bandung: Penerbit ITB.
Rodig,O.R. 1997. Organic Chemistry Laboratory: Standart and Microscale Experiment. California: Saunders College Publishing.
Sastrohamidjojo, H. 1996. Sintesis Bahan Alam. Yogyakarta: Penerbit Gadjah Mada University Press.
Schutz,B.1995. Prenylated Flavanones from Leaves of Macaranga Pleiostemona. Port Moresby: University of Papua New Guinea
Silverstein, R. M. 1986. Penyidikan Spektrometrik Senyawa Organik. Terjemahan A. J. Hatomo dan Anny Viktor Purba. Edisi ke-4. Jakarta: Penerbit Erlangga.
Sirait, M. 2007. Penuntun Fitokimia farmasi.ITB Press. Bandung
Sultana,S.1985. Chromenoflavones from Macaranga Indica. Aligarh: Aligarh Muslim University
Lampiran C. Komatogram Lapis Tipis Ekstrak Pekat Metanol Daun Tumbuhan Balik Angin (M.recurvata Gage.) sebelum Kromatografi Kolom I
Keterangan:
Fasa diam : Kieselgel 60 F254
E : Ekstrak pekat metanol daun tumbuhan balik angin (M.recurvata Gage.)
No Fasa gerak Jumlah noda Rf
I n-heksana:etil asetat (90:10) v v⁄ 0 -
Lampiran D. Kromatogram Lapis Tipis Senyawa Hasil Pemisahan dengan Kromatografi Kolom I sebelum Kromatografi Kolom II
Keterangan :
Fase diam : Silika Gel 60 F254
E : Ekstrak Hasil Pemisahan dengan Kromatografi Kolom I : Fasa gerak kloroform : metanol (90:10) v
v
⁄
No Fase gerak Jumlah noda Rf
1 Kloroform:metanol (90:10) v v
⁄ 3 0,92
Lampiran E. Kromatogram Lapis Tipis Ekstrak Kloroform Sebelum KLT Preparatif
Keterangan:
Fasa diam : Kieselgel 60 F254
E : Senyawa Hasil Pemisahan dari Kolom Kromatografi II I : Fasa gerak n-heksana : etanol (80:20) v
v
⁄
II : Fasa gerak kloroform : etil asetat (80:20) v v
⁄
III : Fasa gerak n-heksana : etil asetat (60:40) v v
⁄
IV : fasa gerak benzena : eter (80:20) v v⁄
No Fasa gerak Jumlah noda Rf
I n-heksana : etanol (80:20) v⁄v 1 0,86
II kloroform : etil asetat (80:20) v⁄v 1 0,64
III n-heksana : etil asetat (60:40) v⁄v 2 0,56
0,62
IV benzena : eter (80:20) v v⁄ 4 0,14
Lampiran F. Kromatogram Lapis Tipis Senyawa Murni Hasil Isolasi
Keterangan:
Fasa diam : Kieselgel 60 F254
E : Ektrak Pekat Metanol Daun Tumbuhan Balik Angin (M.recurvata Gage.)
I : Fasa gerak benzene:eter (80:20) v v
⁄
II : Fasa gerak n-heksan:etil asetat (60:40) v v
⁄
III : Fasa gerak Kloroform:metanol (90:10) v v
⁄
No Fase Gerak Jumlah noda Rf
1 Benzene:eter (80:20) v v
⁄ 1 0,35
2 N-heksan:etil asetat (60:40) v⁄v 1 0,42
