BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.3. Prosedur Penelitian
Kitosan yang akan digunakan yaitu hasil produksi dari BATAN yang sudah tersedia dan telah melalui proses demineralisasi, deproteinasi, dan deasetilasi.
3.3.2 Iradiasi Kitosan
Pada proses iradiasi terhadap kitosan, sumber radiasi yang digunakan yaitu menggunakan radiasi gamma 60Co dengan berbagai dosis iradiasi. Kitosan dikemas ke dalam tiga plastik klip untuk tiga dosis dan masing-masing diberi label dosis energi radiasi yaitu 50, 100, dan 150 kGy. Kemudian kitosan yang telah dikemas tersebut dimasukkan ke dalam alat iradiator. Iradiasi tersebut dilakukan dengan kecepatan dosis 10 kGy/jam.
3.3.3 Perhitungan Derajat Deasetilasi (Czechowska-Biskup, 2012)
Perhitungan derajat deasetilasi (DD) kitosan dengan menggunakan instrument 1H-NMR. Serbuk Kitosan dilarutkan dalam larutan D2O dan asam asetat D2O sampai kitosan larut sempurna, kemudian diinjekkan ke dalam instrument 1H-NMR, lalu dibaca hasilnya.
3.3.4 Pengukuran Berat Molekul Viskositas (Mv) Kitosan (Hwang, et al, 1997)
a. Pembuatan 0,2 M Asam asetat
Sebanyak 12 g asam asetat dilarutkan dalam 1000 mL aquades. b. Pembuatan 0,1 M Natrium asetat
Sebanyak 8,2 g Natrium asetat dilarutkan dalam 1000 mL aquades. c. Pembuatan Buffer asetat pH 4,3 250 mL
Menghitung pH 4,3 untuk mendapatkan volume (mL) asam asetat 0,2 M yang diperlukan yaitu sebanyak 147,2 mL, kemudian hitung volume (mL) natrium asetat yang diperlukan untuk ditambahkan ke dalam asam asetat yaitu sebanyak 102,8 mL.
d. Pembuatan larutan kitosan 0,1 % dalam larutan Buffer pH 4,3 Sebanyak 0,05 g kitosan dilarutkan dalam 50 mL Buffer pH 4,3. e. Pembuatan larutan kitosan 0,2% dalam larutan Buffer pH 4,3
Sebanyak 0,1 g kitosan dilarutkan dalam 50 mL Buffer pH 4,3. f. Pembuatan larutan kitosan 0,3% dalam larutan Buffer pH 4,3
Sebanyak 0,15 g kitosan dilarutkan dalam 50 mL Buffer pH 4,3. g. Pembuatan larutan kitosan 0,4% dalam larutan Buffer pH 4,3
Sebanyak 0,2 g kitosan dilarutkan dalam 50 mL Buffer pH 4,3.
Semua konsentrasi larutan kitosan dibuat triplo untuk masing-masing kitosan hasil iradiasi (50 kGy, 100 kGy, 150 kGy) dan kitosan non iradiasi, kemudian setelah larutan kitosan dibuat didiamkan terlebih dahulu minimal selama 24 jam dan maksimal 3 hari sebelum digunakan. Setelah itu sebanyak 10 mL pelarut dimasukkan ke dalam tabung ostwald, kemudian tabungnya dimasukkan ke dalam media air (25oC), kemudian larutan dihisap dengan pushball hingga melewati 2 batas dibagian atas viskometer, lalu kendurkan cairan sampai batas pertama lalu mulai perhitungan menggunakan stopwatch (dalam detik) hingga batas kedua. Hasil yang diperoleh dicatat. Pengukuran dilakukan sebanyak tiga kali. Langkah yang sama dilakukan untuk larutan kitosan 0,1 %; 0,2%; 0,3%; dan 0,4% dari kitosan hasil iradiasi dan non iradiasi. Viskositas spesifik dihitung dengan persamaan di bawah ini:
ƞsp
Dimana ƞsp adalah viskositas spesifik, t2 adalah waktu alir untuk larutan dan t1 adalah waktu alir untuk pelarut. Viskositas intrinsik diperoleh
dengan memplotkan hasil ƞsp/C terhadap C. Kemudian berat molekul viskositas kitosan dihitung dengan menggunakan persamaan Mark-Houwink:
[h ]= k.M α Keterangan:
[h] = Viskositas intrinsik
24
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
k dan α = Tetapan khas untuk polimer dan pelarutnya (K= 1.181 x 10-3 dan α = 0.93 pada suhu 250C)
3.3.5 Pengujian Penurunan Kadar Kolesterol secara In Vitro (Rudel and Morris, 1973; Sutioso, 2012; Rao, 1992; Nalole, 2009)
3.3.5.1 Pembuatan Reagen FeCl3
Sebanyak 8,402 gram FeCl3.6H2O dilarutkan dalam 100 mL asam asetat glasial, larutan ini akan tetap stabil hingga beberapa bulan kedepan.
3.3.5.2 Pembuatan Asam Asetat 1%
Sebanyak 1 mL Asam Asetat glasial dan ad 100 mL dengan aquades.
3.3.5.3 Pembuatan Larutan Baku Kolesterol Etanol
Dibuat larutan induk kolesterol dengan konsentrasi 1000 ppm yaitu dengan cara melarutkan 100,0 mg serbuk kolesterol dalam 100 mL etanol absolut (95%) pada suhu ± 45oC diatas waterbath.
3.3.5.4 Pembuatan Kurva Standar
a. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (λmaks)
Dilakukan scanning panjang gelombang dari larutan standar kolesterol dengan konsentrasi 100 ppm dalam labu 5 mL yang diambil dari larutan induk 1000 ppm sebanyak 0,5 mL lalu di ad dengan etanol 95% sampai volum 5 mL, kemudian ditambahkan 2,0 mL reagen FeCl3 kemudian divorteks dan didiamkan selama 10 menit, dan menutup lapisan luar tabungnya dengan alumunium voil untuk melindungi dari cahaya. Lalu masing-masing larutan ditambahkan 1,0 mL H2SO4(p) dan campuran larutan dihomogenkan dengan menggunakan vorteks, kemudian didiamkan selama 30 menit. Dilakukan pengukuran menggunakan spektrofotometer UV-Vis dengan panjang gelombang 400-700 nm.
b. Pembuatan Seri Konsentrasi Larutan Baku Kolesterol dan Pengukuran Kurva standar
Dari larutan induk kolesterol konsentrasi 1000 ppm dibuat 5 seri konsentrasi yaitu diambil dari larutan induk tersebut sebanyak 0,5; 0,75; 1; 1,25; dan 1,5 mL kemudian dicukupkan volumenya masing-masing hingga 5 mL dengan etanol 95%, sehingga dihasilkan masing-masing larutan dengan konsentrasi 100, 150, 200, 250, dan 300 ppm. Masing-masing larutan tersebut ditambahkan 2,0 mL reagen FeCl3 kemudian divorteks dan didiamkan selama 10 menit, dan menutup lapisan luar tabungnya dengan alumunium voil untuk melindungi dari cahaya. Lalu masing-masing larutan ditambahkan 1,0 mL H2SO4(p) dan campuran larutan dihomogenkan dengan menggunakan vorteks, kemudian didiamkan selama 30 menit dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum 526 nm sesuai hasil scanning sebelumnya. 3.3.5.5 Pengukuran Kadar Kolesterol
Sampel kitosan hasil iradiasi (50 kGy, 100 kGy, 150 kGy) dan non iradiasi masing-masing ditimbang sebanyak 30,0 mg (triplo) lalu masing-masing dilarutkan dengan asam asetat 1% sebanyak 20 tetes, kemudian masing-masing ditambahkan 5 mL larutan kolesterol dengan konsentrasi 300 ppm. Campuran masing-masing larutan dihomogenkan dengan menggunakan vorteks dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit, kemudian disentrifus pada 4000 rpm selama 5 menit. Masing-masing kolesterol yang tersisa dalam supernatan diambil (5 mL) dan dipindahkan ke dalam tabung reaksi bertutup. Masing-masing supernatan tersebut ditambahkan 2,0 mL reagen FeCl3 kemudian divorteks dan didiamkan selama 10 menit, dan menutup lapisan luar tabungnya dengan alumunium voil untuk melindungi dari cahaya. Lalu masing-masing larutan ditambahkan 1,0 mL H2SO4(p) dan campuran larutan dihomogenkan dengan menggunakan vorteks, dengan demikian jumlah pengenceran terhadap awal sebanyak 5/6 dan dilanjutkan dengan 5/8, sehingga total pengenceran 5/6 x 5/8 = 25/48. Kemudian didiamkan selama 30 menit dan diukur absorbansinya pada panjang
26
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
gelombang maksimum 526 nm sesuai hasil scanning sebelumnya. Kurva standar digunakan untuk menentukan konsentrasi kolesterol yang tersisa.
Persentase penurunan kadar kolesterol ditentukan dengan rumus :
A = X100%
C B C
Keterangan :
A = % penurunan kadar kolesterol
B = kadar kolesterol akhir dikali pengenceran 48/25 C = kadar kolesterol awal
3.3.5.6 Analisa Data
Data yang diperoleh dianalisis dengan uji Saphiro Wilk untuk melihat distribusi data dan dianalisis dengan uji Levene untuk melihat homogenitas data. Jika data terdistribusi normal dan homogenitas maka dilanjutkan dengan uji Analysis of Variance (ANOVA) satu arah dengan taraf kepercayaaan 95% sehingga dapat diketahui apakah perbedaan yang diperoleh bermakna atau tidak dengan nilai signifikansi
(p≤0,05). Jika terdapat perbedaan bermakna, dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Terkecil (BNT) dengan metode LSD (Least Significant Difference) (Santoso, 2008).