METODOLOGI PENELITIAN
3.8 Prosedur Penelitian
3.8.1 Persiapan Hewan Percobaan
Tikus diaklimatisasi selama satu minggu dan ditempatkan di dalam kandang yang terbuat dari bahan plastik (ukuran 50 x 30 x 20 cm3) yang ditutup dengan kawat kasa. Setiap kandang diisi paling banyak 5 ekor tikus. Tikus yang sakit saat aklimatisasi segera di ganti dengan tikus lain dengan kriteria yang sama yang diambil secara acak. Dasar kandang dilapisi dengan sekam padi setebal 0,5 – 1 cm dan diganti setiap tiga hari. Cahaya ruangan dikontrol persis 12 jam terang (pukul 06.00 sampai dengan pukul 18.00) dan 12 jam gelap (pukul 18.00 sampai dengan pukul 06.00), sedangkan suhu dan kelembaban ruangan dibiarkan berada pada kisaran alamiah. Diberikan makanan standard yang sama untuk tiap kelompok, sedangkan pemberian minuman diberikan secara ad libitum. Pemberian makanan dan minuman disuplai setiap hari.
Penelitian diawali dengan mempersiapkan tikus Wistar jantan usia 2 – 3 bulan sejumlah 36 ekor yang diadaptasi selama 7 hari dengan pemberian pakan standar. Berat badan tikus ditimbang sebagai data dasar. Tikus kemudian dikelompokkan secara acak menjadi 6 kelompok, tiap kelompok terdiri dari 6 ekor.
3.8.2 Ransum Pakan Standar
Ransum pakan standar adalah makanan bagi semua tikus selama penelitian dengan dosis 20 g/ekor/hari. Ransum pakan dibuat berdasarkan diet murni dari PT. Charoen Pokphan, Tanjung Morawa, Medan.
3.8.3 Pemberian Air Minum
Air minum untuk semua tikus adalah aquadest. Air minum diberikan ad libitum. 3.8.4 Pembagian Kelompok dan Pemberian Perlakuan
Pembagian kelompok dan pemberian perlakuan pada penelitian ini adalah:
a. Tikus sebanyak 36 ekor dibagi dalam enam kelompok secara random sehingga dalam satu kelompok terdiri atas enam ekor tikus. Pembagian kelompoknya adalah :
i. Kelompok P0 = terdiri dari 6 ekor tikus jantan dewasa yang diberi minum aquadest, pakan biasa selama 56 hari, dan suntikan citrate buffer pada hari ke 15 dan 22.
ii. Kelompok P1 = terdiri dari 6 ekor tikus jantan dewasa yang diberi perlakuan diet tinggi lemak selama 14 hari, lalu diberikan suntikan STZ dosis rendah 30 mg/kgBB pada hari ke 15 & 22.
iii. Kelompok P2 = terdiri dari 6 ekor tikus jantan dewasa yang diberi perlakuan diet tinggi lemak bersamaan dengan ekstrak etanol jamur tiram putih 200 mg/kgBB selama 2 minggu, yang kemudian diberikan suntikan STZ dosis rendah 30 mg/kgBB pada hari ke 15 dan 22, lalu pemberian ekstrak etanol jamur tiram putih terus dilanjutkan sampai 1 minggu setelahnya.
iv. Kelompok P3 = terdiri dari 6 ekor tikus jantan dewasa yang diberi perlakuan diet tinggi lemak bersamaan dengan ekstrak etanol jamur tiram putih 250 mg/kgBB selama 2 minggu, yang kemudian diberikan suntikan STZ dosis rendah 30 mg/kgBB pada hari ke 15 dan 22, lalu pemberian ekstrak etanol jamur tiram putih terus dilanjutkan sampai 1 minggu setelahnya.
v. Kelompok P4 = terdiri dari 6 ekor tikus jantan dewasa yang diberi perlakuan diet tinggi lemak selama 14 hari, lalu diberikan suntikan STZ dosis rendah 30 mg/kgBB pada hari ke 15 dan 22, lalu diberikan ekstrak etanol jamur tiram putih sebanyak 200 mg/kgBB selama 28 hari.
vi. Kelompok P5 = terdiri dari 6 ekor tikus jantan dewasa yang diberi perlakuan diet tinggi lemak selama 14 hari, lalu diberikan suntikan STZ dosis rendah 30 mg/kgBB pada hari ke 15 dan 22, lalu diberikan ekstrak etanol jamur tiram putih sebanyak 250 mg/kgBB selama 28 hari.
b. Pemberian pakan tinggi lemak (kuning telur bebek) dilakukan dengan cara pencekokan dan dilakukan setiap hari pada pukul 09.00 WIB.
c. Pemberian ekstrak etanol jamur tiram putih dilakukan dengan cara pencekokan dan dilakukan setiap hari pada pukul 14.00 WIB.
d. Penyuntikan STZ dosis rendah (30 mg/kgBB) dilakukan dengan sebelumnya tikus dipuasakan semalaman, lalu pagi pada pukul 09.00 WIB sebelum pemberian pakan tinggi lemak dilakukan penyuntikan STZ intraperitoneal. e. Selama 7 hari tikus diadaptasikan dengan lingkungan tempat penelitian dan
diberi makanan standar untuk tikus. f. Berat badan awal tikus ditimbang.
g. Setelah 58 hari perlakuan, dilakukan dislokasi leher tikus. Abdomen dibuka dengan insisi mid-line, dilakukan pemisahan pankreas, lalu pankreas direndam didalam formalin buffer untuk selanjutnya dilakukan pembuatan sediaan histologi.
h. Dilakukan analisis dari data-data KGD dan gambaran imunohistokimia area sel beta pankreas.
3.8.5 Pembuatan Ekstrak Etanol Jamur Tiram Putih (Pleurotus ostreatus) 3.8.5.1.Proses pengambilan bahan
Bahan yang digunakan adalah jamur Pleurotus ostreatus yang masih segar dan baru dipanen. Pengambilan bahan dilakukan dengan cara purposif tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Bahan diperoleh dari pusat budidaya jamur tiram Khalisa Agro Mushroom, beralamat di Jl. Tampok Tanjung Selamat Gg. Seni no.2, Sunggal Sumatera Utara.
3.8.5.2.Proses pembuatan ekstrak
Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai. Kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan. Ekstrak cair adalah sediaan cair simplisia nabati, yang mengandung etanol sebagai pelarut atau sebagai pengawet atau sebagai pelarut dan pengawet. Ekstrak cair yang cenderung membentuk endapan dapat didiamkan dan disaring atau bagian yang bening dienaptuangkan. Beningan yang diperoleh memenuhi persyaratan farmakope. Ekstrak cair dapat dibuat dari ekstrak yang sesuai. (Depkes, 1995)
Berikut prosedur pembuatan ekstrak etanol jamur tiram putih hingga dalam bentuk suspensi yang siap diberikan kepada tikus :
1. Sebanyak 25 kg jamur tiram putih pasca panen, keseluruhan bagian jamur dipotong-potong tipis lalu dikeringkan. Pengeringan menggunakan oven pada suhu 38 – 40 0C sampai potongan buah benar-benar kering (rapuh). Lamanya waktu yang dibutuhkan untuk pengeringan sekitar 4-5 hari. Berat jamur setelah dikeringkan sekitar 2874 g.
2. Jamur yang telah benar-benar kering ini dihaluskan dengan menggunakan alat penggiling. Hasil penggilingan diperoleh serbuk (simplisia) sekitar 1421,5 g. Simplisia ini kemudian diekstrak dengan menggunakan metode maserasi.
3. Maserasi dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 1000 g simplisia direndam di dalam 4 liter larutan etanol 96% yang sebelumnya telah didestilasi. Perendaman dilakukan selama 3 hari 3 malam sambil sesekali diaduk. Setelah 3 hari, campuran simplisia dan pelarut kemudian disaring kedalam penyaring. Residu yang dihasilkan dari penyaringan tersebut direndam kembali dengan pelarut yang sama sebanyak 4 liter selama 3 hari 3 malam, kemudian disaring kembali. Siklus ini diulang sekali lagi dengan cara yang sama. Filtrat yang diperoleh dari hasil penyaringan, diuapkan menggunakan rotary evaporator pada kisaran temperatur 40 – 60 0C, dan diperolehlah ekstrak kental jamur PO sebanyak 540,2 g.
4. Selanjutnya ekstrak kental ini dikeringkan dengan menggunakan freeze dryer
untuk menguapkan pelarut yang masih tersisa, hingga diperoleh ekstrak kering jamur PO sebanyak 254,3 g. Selanjutnya ekstrak kering akan dijadikan suspensi dengan pelarut Na-CMC 1%.
5. Pembuatan larutan Na-CMC 1%. Na-CMC ditimbang seberat 20 g dan dilarutkan dalam 400 mL aquadest. Na-CMC dibiarkan mengambang diatas aquadest selama kurang lebih 15 menit sambil diaduk. Setelah terbentuk massa yang homogen (merata) ditambahkan air ke dalam massa tersebut hingga diperoleh volume 2000 mL sambil terus diaduk.
6. Pembuatan suspensi ekstrak etanol jamur PO (Suspensi 4 %). Pembuatan suspensi ekstrak etanol jamur dilakukan setiap hari. Ekstrak kering jamur PO ditimbang sebanyak 0,6 g dan dimasukkan ke dalam lumpang. Kemudian ditambahkan 10 mL larutan Na-CMC 1% sedikit demi sedikit sambil dilakukan penggerusan supaya didapatkan larutan yang homogen. Larutan yang sudah homogen selanjutnya dipindahkan ke dalam gelas ukur dan ditambahkan lagi Na-CMC hingga volume akhir 15 ml. Suspensi ini kemudian diberikan secara oral ke tikus dengan dosis 200 mg/kgBB dan 250 mg/kgBB tikus.
3.8.6 Penentuan Dosis
1. Perhitungan dosis ekstrak etanol jamur tiram puti
Dosis ektrak jamur tiram putih yang digunakan untuk berbagai kondisi patologis adalah antara 200-250 mg/kg BB tikus (Isai et al. 2009). Dosis ekstrak jamur tiram putih yang digunakan pada penelitian ini adalah sebesar 200 mg/kg BB dan 250 mg/kgBB. Tikus ditimbang berat badannya setiap minggu, dan larutan ekstrak etanol jamur tiram putih akan diberikan sesuai dengan berat badan masing-masing tikus. Perhitungan dosis mingguan dilakukan dengan mempertimbangkan besar kadar air pada ekstrak jamur PO yang digunakan pada penelitian ini yaitu sekitar 8%.
Kuning telur bebek diberikan sebanyak 1 cc/tikus/hari dengan melihat kapasitas lambung tikus yang bisa menampung 3-5 cc. Pada penelitian sebelumnya dengan dosis 1 cc bisa meningkatkan kadar kolesterol dan berat badan tikus dalam waktu 2 minggu.
3. Perhitungan dosis STZ
Dosis STZ yang diberikan adalah dosis rendah multipel sebanyak 30 mg/kgBB yang dilarutkan dalam citrate buffer pH 4,5. Jika seminggu setelah penyuntikan pertama tidak terjadi kenaikan KGD diatas 140 mg/dL maka dilakukan penyuntikan ke-2 (Srinivasan et al., 2005).
3.8.7 Alur Penelitian
Secara skematis, alur alur penelitian ini ditunjukkan pada Gambar 3.1.
Tikus jantan galur wistar, 36 ekor, 2-3 bulan, BB 150-250 gram
Adaptasi selama 7 hari
Tikus dibagi menjadi 6 kelompok
Kelompok kontrol P0 Kelompok P1 Kelompok P2 Kelompok P3
Akuades 0,5ml selama 56 hari
+
Pakan biasa selama 56 hari
+
Suntikan citrate buffer
IP hari ke 15 & 22 Akuades 0,5ml selama 56 hari + HFD 1 cc/hari selama 14 hari (dilanjut dengan pakan biasa hingga hari ke 56)
+ STZ 30 mg/kgBB IP hari ke 15 & 22 Akuades 0,5ml + HFD 1 cc/hari selama 14 hari (dilanjut dengan pakan biasa hingga hari ke 56)
+ STZ 30 mg/kgBB IP hari ke 15 & 22 + Ekstrak PO 200 mg/kg BB Sampai hari ke 28 Akuades 0,5ml + HFD 1 cc/hari selama 14 hari (dilanjut dengan pakan biasa hingga hari ke 56)
+ STZ 30 mg/kgBB IP hari ke 15 & 22 + Ekstrak PO 250 mg/kgBB Sampai hari ke 28
Pengukuran KGD + pemeriksaan histologi pankreas (data post test)
Analisis data
Kelompok P4
Akuades 0,5ml + HFD 1 cc/hari selama 14 hari (dilanjut dengan pakan biasa hingga hari ke 56)
+ STZ 30 mg/kgBB IP hari ke 15 & 22 + Ekstrak PO 200 mg/kgBB Hari ke 29 - hari ke 56 Kelompok P5 Akuades 0,5ml + HFD 1 cc/hari selama 14 hari (dilanjut dengan pakan biasa hingga hari ke 56)
+ STZ 30 mg/kgBB IP hari ke 15 & 22 + Ekstrak PO 250 mg/kgBB Hari ke 29 - hari ke 56