BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.8 Prosedur Penelitian
a. Persiapan penelitian
1. Penelitian dilakukan setelah mendapat persetujuan komite etik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.
2. Validasi metode analisis
Validasi metode analisis dilakukan sebelum pemeriksaan sampel dilakukan.Akurasi (ketelitian/kecermatan) merupakan ukuran perbedaan atau kedekatan antara rata-rata hasil uji dengan nilai sebenarnya (true value). Nilai akurasi ditentukan dari besarnya penyimpangan data hasil uji dengan nilai sesungguhnya (true value). Akurasi dapat dinyatakan sebagai koefisien variasi (CV) dengan melakukan pengulangan uji sebanyak 5 x pada sampel yang sama dan dihitung dengan Rumus :
Rumus koefisien variasi :
Penentuan Katagori Subjek Penelitian: Anamnesa
Pengukuran BMI, Lp, Lemak Sub cutan
Obesitas Normal
Pengambilan sampel darah
Pemeriksaan Kadar Leptin Pemeriksaan Estradiol
Pemeriksaan Profil Lipid
Analisa Hasil Overweight
Ket :
CV : Koefisien variasi SD : standar deviasi
X : rata-rata hasil pemeriksaan setiap prosedur
b. Sebagai skrining awal,subjek di anamnesa tentang umur , riwayat kesehatan dan data indeks massa tubuh, lingkar pinggang dan lemak sub cutan. Subjek yang masuk kriteria inklusi kemudian melakukan prosedur informed consent yang dilakukan peneliti. Peneliti akan menjelaskan seluruh prosedur penelitian. Bila subjek bersedia ikut serta dalam penelitian, dipersilahkan menandatangani formulir persetujuan. Subjek akan mendapatkan salinan lembar persetujuan.
c. Pengukuran berat badan (BB) dan tinggi badan (TB)
Penimbangan berat badan dilakukan dengan timbangan digital Merk GEA. Pengaktifan alat timbang dengan cara menekan permukaan timbangan. Mula- mula akan muncul angka bervariasi dan tunggu sampai muncul angka 0,00. berarti timbangan siap digunakan
1) Responden diminta naik ke alat timbang dengan posisi kaki tepat di tengah alat timbang tetapi tidak menutupi jendela baca tanpa menggunakan alas kaki.
2) Perhatikan posisi kaki responden tepat di tengah alat timbang, sikap tenang dan kepala memandang lurus kedepan.
3) Angka di monitor alat timbang akan muncul, dan tunggu sampai angka tidak berubah (Statis)
4) Catat angka yang terakhir
5) Angka hasil penimbangan diambil sampai 1 angka dibelakang koma 6) Minta Responden turun dari alat timbang
7) Alat timbang akan Off secara otomatis.
Pengukuran tinggi badan dilakukan dengan menggunakan alat ukur tegak (microtaise) dengan kapasitas 2 meter sampai ketepatan 0,1 cm. Hasil dibaca dalam cm.
1) Minta responden melepaskan alas kaki (sandal/sepatu), topi (penutup kepala).
2) Pastikan alat geser berada diposisi atas.
3) Reponden diminta berdiri tegak, persis di bawah alat geser.
4) Posisi kepala dan bahu bagian belakang, lengan, pantat dan tumit menempel pada dinding tempat microtoise di pasang.
5) Pandangan lurus ke depan, dan tangan dalam posisi tergantung bebas. 6) Gerakan alat geser sampai menyentuh bagian atas kepala responden.
Pastikan alat geser berada tepat di tengah kepala responden. Dalam keadaan ini bagian belakang alat geser harus tetap menempel pada dinding.
7) Baca angka tinggi badan pada jendela baca ke arah angka yang lebih besar (ke bawah ) Pembacaan dilakukan tepat di depan angka (skala) pada garis merah, sejajar dengan mata petugas.
8) Apabila pengukur lebih rendah dari yang diukur, pengukur harus berdiri di atas bangku agar hasil pembacaannya benar.
9) Pencatatan dilakukan dengan ketelitian sampai satu angka dibelakang koma.
d. Pengukuran lingkar pinggang dilakukan dengan posisi responden berdiri tegak dan diukur diantara crista illiaca dan costa XII. Katagori IDF 2006, obesitas pada wanita bila lingkar pinggang > 80 cm.
e. Pengukuran lemak subcutan pada area triseps dilakukan dengan posisi berdiri tegak. Pengukuran pada bagian lateral lengan dengan bahu dengan sudut 90˚ menggunakan pita pengukur. Titik tengah ditandai pada sisi samping lengan. Pengukuran diambil 1 cm diatas tanda tersebut dengan menggunakan Skinfold caliper. Obesitas pada wanita bila lemak triseps > 25,1 mm (Ramayulis, 2013). Pengukuran dilakukan 3 kali, dan diambil hasil rata2 dari ketiga pemeriksaan tersebut. Dan pencatatan dilakukan dengan ketelitian 1 angka dibelakang koma.
Pengambilan dan pemeriksaan sampel darah : 1. Pengambilan sampel
Dilakukan pada pagi hari (Pkl. 08.00 – 10.00 WIB) setelah subjek berpuasa selama 10-12 jam. Pengambilan sampel dilakukan dengan mengambil darah vena cubiti sebanyak 6 ml, dibagi dua dan dimasukkan kedalam 2 tabung. Tabung pertama berisi EDTA dan tabung kedua berisi clot activator.
a. Pengolahan serum
1) Masukkan 3 ml darah kedalam tabung yang telah berisi clot activator 2) Diamkan 10-15 menit
3) Centrifugasi selama 8 menit dengan kecepatan 3200 rpm
4) Ambil serum yang berada dibagian atas tabung dan masukkan ketabung evendrof.
5) Simpan dalam lemari es dengan suhu - 20˚C b. Pengolahan plasma
1) Masukkan 3 ml darah kedalam tabung yang telah berisi EDTA 2) Diamkan selama 10 menit
3) Centrifugasi selam 8 menit dengan kecepatan 3200 rpm
4) Ambil plasma yang berada dibagian atas tabung dan masukan ketabung evendrof.
5) Simpan dalam lemari es dengan suhu - 20˚C
Plasma pada tabung EDTA akan digunakan untuk pemeriksaan Leptin Plasma, sedangkan serum pada tabung biasa akan digunakan untuk pemeriksaan profil lipid dan kadar estradiol. Serum untuk pemeriksaan profil lipid, estradiol dan plasma untuk pemeriksaan leptin disimpan dalam suhu -20 ˚C sampai diperiksa.
2. Pemeriksaan Profil Lipid
1) Pemeriksaan Total Cholesterol
Pemeriksaan kolesterol total dilakukan dengan teknik kimiawi menggunakan reaksi enzimatis cholesterol oxidase peroxidase/phenol/4- aminophenazone (metode CHOD-PAP) .
a) Prinsip pemeriksaan
Kolesterol ditentukan setelah hidrolisis dan oksidasi enzimatis. Indicator kalorimetri quinoneimine terbentuk dari 4-aminoantipyrine
dan phenol dengan adanya hydrogen peroxidase dibawah pengaruh katalitik peroxidase.
Reaksi kimia yang terjadi dalam pemeriksaaan adalah :
b) Komposisi reagensia
R1 4 x 100 ml reagen enzyme
Phosphase buffer (pH 6,5) 100 mmol/l
4 aminophenazone 0,25 mmol/l
Phenol 5 mmol/l
Peroxidase > 5 KU/l
Cholesterol esterase >150 U/l
Cholesterol oxidase >100 U/l
Sodium azide 0,05 %
23 ml standar : cholesterol 200 mg/dl atau 5,17 mmol/l c) Persiapan reagen
Reagen enzyme (R1) dan standar (2) telah siap digunakan. Specimen yang digunakan untuk pemeriksaan ini adalah serum. d) Prosedur
1. Larutan disiapkan dengan komposisi ; Reagent Blanko Sampel atau standar Sampel/standar R1 - 1000 µl 10 µl 1000 µl
2. Larutan yang telah dicampur dan Inkubasi selama 10 menit dalam suhu 37˚C atau 20 menit dalam suhu 20-25 ˚C. 3. Baca absorbansi sampel dan standar dengan panjang
gelombang 500 nm dalam waktu 60 menit dan bandingkan dengan blangko.
e) Kalkulasi
Cholesterol (mg/dL) = 200 x Absorbansi sampel (mg/dL) Absorbansi standar
2) Pemeriksaan LDL cholesterol
Konsentrasi kolesterol-LDL (LDL-C) dihitung berdasarkan kadar kolesterol total, kolesterol HDL dan trigliserida dengan menggunakan rumus Fried dan Wald yaitu;
LDL-C = TC – (HDL-C) – TG/5 (mg / dl) LDL-C = TC – (HDL-C) – TG/2.2 (mmol / l) Ket: TC ; Total Cholesterol HDL-C ; HDL Cholesterol TG ; Trigliserida 3) Pemeriksaan Kolesterol HDL
Pengukuran kadar kolesterol HDL dilakukan dengan teknik presipitasi yang dilanjutkan dengan pemeriksaan cholesterol liquicolor.
a) Prinsip pemeriksaan
Pemeriksaan kolesterol HDL diawali dengan pemisahan kolestreol HDL dengan menggunakan reagensia presipitan. Kilomikron, very low density lipoprotein (VLDL) dan LDL serum dipresipitasi dengan
menambahkan phosphotungistic acid dan magnesium klorida (MgCLЇ). Setelah sentrifugasi, supernatan yang diperoleh mengandung HDL. Kemudian diperiksa kadarnya dengan menggunakan human cholesterol liquicolor.
b) Persiapan reagensia
Reagen presipitan 4 x 80 ml presipitan
Phosphotungesic acid 0,55 mmol/l
Magnesium klorida 25 mmol/l
Standar 1 x 3 ml standar : kolesterol 50 mg/dl (1,29 mmol/l) c) Specimen yang digunakan adalah serum
d) Prosedur persiapan cholesterol presipitan 1. Pipet kedalam tabung sentrifugasi
Makro Semi Mikro
Sampel Presipitan a Presipitan b 500 µl 1000 µl - 200 µl - 500 µl
2. Larutan dicampur dan inkubasi selama 10 menit pada suhu 20-25 ˚c kemudian disentrifugasi selama 2 menit 10000 g.
3. Supernatant dipisahkan dalam 1 jam dan diperiksa dengan menggunakan human cholesterol liquicolor.
1. Larutan disiapkan dengan komposisi
Blanko Standar Sampel
Aqua Destilata Standar Supernatant HDL HCL 100 µl - - 1000 µl - 100 µl - 1000 µl - - 100 µl 1000 µl
2. Campurkan larutan dan inkubasi selama 10 menit pada suhu 20-25 ˚C.
3. Ukur nilai absorbansi dengan panjang gelombang 500 nm dalam waktu 60 menit. Bandingkan nilai absorbansi sampel dan standar dengan blanko.
a. Kalkulasi
Kadar kolesterol HDL = 150 x Absorbansi sampel (mg/dl) Absorbansi standar
f) Pemeriksaan Trigliserida
Pemeriksaan trigliserida dilakukan dengan teknik kimiawi menggunakan reaksi enzimatis gliserol phosphate oxidase- peroxidase phenol/4-aminoantipyrine (metode GPO-PAP) .
a) Prinsip pemeriksaan
Trigliserida ditentukan setelah hidrolisis enzymatic dengan lipoprotein lipase. Indicator quinoneimine terbentuk dari 4 aminoantipyrine dan 4-chlorophenol oleh hydrogen peroxidase dibawah pengaruh katalitik peroxidase. Reaksi kimia yang terjadi dalam pemeriksaan ini adalah :
HЇOЇ+4-aminoantypyrine peroxidase quinoneimine+HCL+HЇO+4 Chlorophenol
b) Komposisi Reagent
15 ml; 100 ml atau 250 ml monoreagent
Pipet buffer (pH 7,5) 50 mmol/l
4 chlorophenol 5 mmol/l
4 aminophenazone 0,25 mmol/l
Magnesium ions 4,5 mmol/l
ATP 2 mmol
Lipase ≥1300 I/l
Peroxidase ≥500 U/l
Glycerol kinase ≥400 U/l
Glycerol 3 phosphate oxidase ≥1500 U/l
Sodium azide 0,05 %
Standar Triglycerides 200 mg c) Specimen yang digunakan adalah serum d) Prosedur
1. Larutan disiapkan dengan komposisi ;
Blanko Sampel /standar Sampel/standar Reagent - 1000 µl 10 µl 1000 µl
2. Campurkan larutan dan inkubasi selama 10 menit pada suhu 20- 25 ˚C. Ukur absorbansi sampel dan standard dan dibandingkan dengan blanko dengan panjang gelombang 500 nm dalam waktu 60 menit.
e) Kalkulasi
Trigliserida (mg/dL) = 200 Absorbansi sampel (mg/dl) Absorbansi standar
g) Pengukuran kadar estradiol
Pengukuran kadar estradiol menggunakan The AxSYM Estradiol assay berdasarkan pada teknologi mikropartikel Enzyme Immunoassay (MEIA).
1. Prinsip pemeriksaan SAMPLING CENTER
Micropartikel dalam kit telah dilapisi anti estradiol. Sampel ( Anti- Estradiol coated Microparticles, Estradiol Assay Buffer dan Line Diluent (Solution 4)) dicampurkan dalam sumur yang sama dan membentuk campuran reaksi. Estrogen : konyugasi Alkaline Phosphatase ditambahkan ke sumur kedua. Kemudian segera dipindahkan ke Pusat Pengolahan . Pipetting lebih lanjut dilakukan di Pusat Pengolahan dengan Probe Processing .
Processing center
a. Campuran reaksi pada proses inkubasi . Estradiol dalam sampel berikatan dengan anti - estradiol pada mikropartikel membentuk kompleks antigen-antibodi .
b. Setelah inkubasi , aliquot campuran reaksi dipindahkan ke Matrix Cell. Mikropartikel berikatan secara irreversibel ke matrixs fiber glass.
c. Setelah matrix cell dicuci untuk menghilangkan substans yang tidak berikatan, Estrogen : konyugasi Alkaline Phosphatase kemudian dibagikan ke dalam Matrix Sel dan diinkubasi .
d. Steroid dari konyugasi berikatan dengan tempat yang tersedia pada micropratikel yang sudah dilapisi anti estradiol. Kemudian Matrix Sel dicuci kembali untuk menghilangkan bahan yang tidak terikat .
e. Substrat : 4 - Methylumbelliferyl fosfat , ditambahkan ke dalam Matrix Sel dan fluorescent yang terbentuk diukur dengan MEIA optical assembly
2. Alat dan bahan
Alat : kulkas freezer, centrifuge, Abbot AxSYM System, matrix cell, Vortex, mikropipet, tabung reaksi, sample cup.
3. Bahan :
a. Sampel beku yang tersimpan pada suhu –20 ˚C b. Reagen
1. AxSYM Estradiol Reagent Pack (7A63-20)
a. 1 Botol (12,1 mL) Estrogen: alkaline fosfat terkonyugasi pada TRIS buffer dengan bovine stabilizer . Konsentrasi Minimum : 0,5 mg / mL(botol reagent 1)
b. 1 Botol (5,1mL) Anti - Estradiol (antibody poliklonal kelinci ) dilapisi micropartikel TRIS buffer dengan bovinestabilizer . (botol reagen 2).
c. 1 Botol (5,5 mL) Estradiol Assay Buffer . Citrate glysine buffer yang berisi releasing agen dan surfaktan . ( botol reagen 3)
d. 1 Botol (20 mL) Spesimen Pengencer yang mengandung Tris buffer dengan bovine stabilizer . ( botol reagen 4).
2. AxSYM estradiol master calibrator (7A63-30)
2 Botol ( masing-masing 4 mL) AxSYM Estradiol master Calibrator . berisi TRIS buffer dengan bovine stabilizer
3. AxSYM estradiol standart calibrator (&A63-01)
4. AxSYM estradiol control (7A63-10); 3 Botol (8 mL masing-masing) AxSYM Estradiol Kontrol mengandung estradiol pada TRIS buffer dengan bovine stabilizer
5. Reagensia lain :
a. AxsYM probe cleaning solution (9A35-04/9A35-05) : 2 botol (220 mL masing-masing) berisi 2% Tetraethylammonium Hydroxide (TEAH).
b. Solution 1 (MUP) (8A47-04) 4 Botol (230 mL masing-masing) berisi 4-Methylumbelliferyl Phosphate, 1.2 mM, dalam AMP buffer. Pengawet : Sodium Azide.
c. Solution 3 (Matrix Cell Wash) (8A81-04) 4 Botol (1000 mL masing- masing) berisi 0.3 M Sodium Chloride dalam TRIS Buffer. Pengawet: Sodium Azide dan Antimicrobial Agents.
d. Solution 4 (Line Diluent) (8A46) 1 botol (10 L) berisi 0.1M Phosphate buffer. Pengawet: Sodium Azide dan Antimicrobial Agent.
e. AxSYM probe cleaning solution ( 9A35-05) 4. Prosedur pemeriksaan estradiol
a. Sebelum prosedur uji, pastikan ketersediaan system Matrix Cell, bulk solution dan waste level sudah sesuai.
b. Serum beku dikeluarkan dari freezer agar mencair di suhu ruangan. Specimen diaduk seluruhnya dengan vortex dengan kecepatan rendah dan disentrifugasi pada setiap siklus pembekuan dan pencairan.
c. Sampel dimasukan kedalam sampel CUP minimal 196 µl d. Masukkan reagen pack di carose reagen
e. Masukkan sampel ke carose sesuai dengan posisi order yang telah dilakukan sebelumnya.
f. Tekan running, klik oke. g. Tunggu masa inkubasi h. Tunggu hasil pemeriksaan 5. Hasil
AxSYM Estradiol menggunakan empat Curva Parameter Logistic metode fit (4PLC, Y-weighted) untuk menghasilkan kurva Standard Kalibrasi. Master Kalibrasi menggunakan Teknik A Rasio untuk menyesuaikan master Curva. Kurva standart kalibrasi estradiol menggunakan kurva semi log. Sumbu horizontal (X) berupa kosentrasi estradiol dalam skala lograitmik dan sumbu
vertical (Y) berupa optical density dalam skala linear. Dengan menggunakan skala logaritmik, jarak antara satu titik dengan titik lainnya tidak linear.
B/Bo = Persentase absorbansi standar OD = Optical density
Perhitungan konsentrasi estradiol:
Konsentrasi sampel = Kurva B/Bo (%) x Dilution factor. Hasil dari axSYM estradiol adalah dalam satuan pg/ml. Reference Values :
Follicular Phase : 39- 189 pg/ml a) Pengukuran kadar leptin
Pengukuran kadar leptin dilakukan dengan metode ELISA (Enzyme- linked immunosorbent assay)
1) Prinsip pemeriksaan
DRG leptin Elisa Kit merupakan solid Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) berdasarkan prinsip sandwich. Sumur microtiter telah dilapisi antibody monoclonal yang akan berikatan dengan antigen
spesifik pada molekul Leptin. Specimen yang mengandung leptin diinkubasi pada sumur yang telah dilapisi antibody biotinylated. Terbentuklah kompleks sandwich. Setelah inkubasi, bahan yang tidak terikat dicuci dan kompleks enzyme Steptavidine Peroxidase mendeteksi jumlah Leptin yang terikat. Setelah ditambahakan substrate solution, terbentuklah intensitas warna yang proporsional dengan konsentrasi leptin pada specimen.
2) Reagents
a) Reagents tersedia
1. Microtiter wells, 12x8 strips, 96 wells;Wells dilapisi dengan anti-Leptin antibody (monoclonal).
2. Standard (Standard 0-5), 6 vials, (lyophilized), 0.5 mL; Konsentrasi : 0 – 2 – 5 – 25 – 50 – 100 ng/mL.
3. Kontrol ( rendah dan tinggi), 2 vials, (lyophilized), 0.5 mL. 4. Assay Buffer, 1 vial, 11 mL, siap digunakan.
5. Antiserum, 1 vial, 11 mL, siap digunakan, monoclonal biotinylated anti-Leptin antibody.
6. Enzyme Complex, 1 vial, 11 mL, siap digunakan, horseradish Peroxidase conyugated streptavidin.
7. Substrate Solution, 1 vial, 14 mL, siap digunakan,Tetramethylbenzidine (TMB).
8. Stop Solution, 1 vial, 14 mL siap digunakan, Mengandung 0.5 M H2SO4,
b) Bahan lain yang dibutuhkan
1. Microplate reader yang mampu mengukur absorbansi pada 450 ± 10 nm
2. Micropipet presisi yang terkalibrasi 3. Absorbent paper.
4. Deionized water (aquadest) 5. Timer
6. Software untuk analisis data 3) Persiapan Reagen
Bawa semua reagensia dan sampel ke tempat dengan suhu ruangan sebelum digunakan.
1. Standar
Menyusun kembali isi lyophilized vial standar dengan 0,5 mL Aqua dest dan diamkan minimal selama 10 menit. Goncangkan vial beberapa kali sebelum digunakan. Catatan: Standar yang telah dilarutkan stabil selama minimal 6 minggu pada 2 ° C - 8 ° C. Untuk penyimpanan yang lebih lama dibekukan pada suhu -20 ° C.
2. Kontrol
Menyusun kembali kandungan lyophilized dari vial standar dengan 0,5 mL Aqua dest dan diamkan minimal selama 10 menit. goncangkan vial beberapa kali sebelum digunakan. Catatan: Standar yang telah dilarutkan stabil selama minimal 6 minggu pada
2 ° C - 8 ° C. Untuk penyimpanan yang lebih lama dibekukan pada suhu -20 ° C.
3. Wash Solution
Tambahkan air deionisasi (aquadest) pada 30 ml (40 x consentrat) wash solution dengan mengencerkan 30 mL konsentrat wash solution dengan 1170 ml aquadest untuk mencapai volume akhir sebesar 1200 ml. Wash Solution yang diencerkan stabil selama 2 minggu pada suhu kamar.
4) Pengumpulan dan Persiapan Spesimen 1. Pengumpulan specimen.
Specimen yang digunakan dalam pengujian ini berupa plasma. darah diambil dengan venipuncture. Spesimen harus ditutup dan dapat disimpan sampai 24 jam pada 2 ° C - 8 ° C sebelum pemeriksaan. Spesimen untuk pemeriksaan dalam waktu yang lama dibekukan pada suhu -20 ° C. sebelum pemeriksaan sampel dicairkan dan harus dibolak-balik beberapa kali.
2. Pengenceran Specimen .
Jika dalam pemeriksaan awal, spesimen ditemukan melebihi standar tertinggi, spesimen dapat diencerkan dengan Standard 0 dan reassayed seperti yang dijelaskan dalam Prosedur Assay. Untuk perhitungan konsentrasi faktor pengenceran ini harus diperhitungkan.
contoh:
(a) Pengenceran 1:10: 10 uL Serum + 90 uL Standard 0 (campurkan)
(b) Pengenceran 1:100: 10 uL pengenceran. 5) Prosedur pemeriksaan
a. Bagikan masing-masing 15 uL Standard, kontrol dan sampel dengan tips ke dalam sumur yang sesuai.
b. Bagikan 100 uL Assay Buffer ke setiap sumur. c. Campurkan dengan menyeluruh dalam 10 detik.
d. Inkubasi selama 120 menit dalam suhu ruangan (tanpa menutupi plate)
e. Goncangkan isi sumur dengan cepat.
f. Bilas sumur 3 kali dengan Wash Solution (300 uL per sumur) yang telah diencerkan . Keringkan sumur dengan kertas penyerap untuk menghapus sisa tetesan.
g. Tambahkan 100 uL antiserum untuk masing-masing sumur. h. Inkubasi selama 30 menit pada suhu kamar.
i. Menggoncang isi sumur dengan cepat
j. Bilas sumur 3 kali dengan Wash Solution yang telah diencerkan (300 uL per sumur). Keringkan dengan kertas penyerap untuk menghilangkan sisa tetesan.
k. Masukkan 100 uL kompleks enzym pada masing-masing sumur dengan baik.
m. Mengguncang isi sumur dengan cepat.
n. Bilas sumur 3 kali dengan Wash Solution yang telah diencerkan (300 uL per sumur). Keringkan dengan kertas penyerap untuk menghapus tetesan sisa.
o. Tambahkan 100 uL Substrat Solution pada masing-masing sumur dengan baik.
p. Inkubasi selama 15 menit pada suhu kamar.
q. Menghentikan reaksi enzimatik dengan menambahkan 50 uL Stop Solution pada masing-masing sumur dengan baik.
r. Tentukan absorbansi (OD) pada 450 ± 10 nm dengan membaca plate mikrotiter.
s. Absorbansi dibaca dalam waktu 10 menit setelah menambahkan Stop solution.
6) Perhitungan Hasil
a. Menggunakan perhitungan dengan menggunakan soft ware curve expert versi 14.
b. Hitung nilai absorbansi rata-rata untuk setiap set standar, kontrol dan sampel pasien.
c. Buatlah sebuah kurva standar dengan memplot absorbansi rata-rata yang diperoleh dari masing-masing standar terhadap konsentrasi dengan nilai absorbansi pada vertikal (Y) axis dan konsentrasi pada horisontal (X) axis masing-masing dalam skala Logaritma.
d. Menggunakan nilai absorbansi rata-rata masing-masing sampel untuk menentukan konsentrasi yang sesuai dari kurva standar. e. Hasil di IFU telah dihitung secara otomatis menggunakan 4 PL (4
Parameter Logistik) curve fit: 4 metode otomatis.
f. Software yang digunakan untuk menganalisa data adalah program Curveexpert versi 1,4.
g. Konsentrasi sampel dapat dibaca langsung dari kurva standar. Sampel dengan konsentrasi yang lebih tinggi dari standar tertinggi diencerkan terlebih dahulu. Untuk perhitungan konsentrasi, dilution factor ini harus dimasukkan dalam perhitungan.
b. Menggunakan Perhitungan Parallel Line Assay (PLA)
Perhitungan dengan metode parallel line pada penelitian ini dilakukan pada 3 (tiga sampel) sebagai pembanding dengan 2 (dua) metode lainnya. Pada metode ini standar didilusi sebanyak 2 x dilusi secara serial dari konsentrasi tertinggi (50 ng/mL) ,25 ng/mL dan 12,5 mL) untuk menggambarkan kurva standar dan sampel. Sampel juga diencerkan secara serial ( N,1/2 dan ¼). Kurva standar dan sampel
harus sejajar dan dibuat pada kertas double Logaritma. Logaritma konsentrasi ditunjukkan pada sumbu horizontal (x), sedangkan optical density (OD) ditunjukkan pada sumbu vertical (y). Logaritma konsentrasi sampel diperoleh dengan cara interpolasi nilai OD sampel terhadap kurva standar.
Gambaran Kurva Standar dan sampel pada metode Parallel Line Assay:
c. Menggunakan perhitungan manual dengan rumus
1. Hitung nilai absorbansi rata-rata untuk setiap set standar, kontrol dan sampel pasien
2. Perhitungan manual untuk menentukan konsentrasi samprl dilakukan dengan menggunakan persamaan matematika yang didapatkan dari nilai kurva standar yang dibuat dengan menggunakan program excel 2007:
Y= f(x)
F (x) = m log 10 (x) + b Dimana : y = optical density
x = Konsentrasi leptin m = Slope
b =intercept
Kurva standar digambarkan pada kertas semi-logaritmik dimana x berupa konsentrasi dalam skala linear dan y adalah optical density (OD) dalam skala logaritmik.
Range nilai normal pemeriksaan leptin : Female : 7.36 ± 3,73 (3,63-11,09)
Melihat berbedanya hasil perhitungan ketiga metode ini, analisis data kadar leptin pada penelitian ini diputuskan menggunakan hasil perhitungan dengan metode manual dengan pertimbangan hasil perhitungan dengan metode ini paling mendekati nilai hasil perhitungan dengan metode parallel line assay yang diakui sebagai cara yang memberikan hasil yang paling mendekati hasil sebenarnya dari analisa parameter dimana kurva konsentrasi versus OD berbentuk sigmoid (Lean et al,1978). Perhitungan menggunakan metode PLA pada keseluruhan sampel pada penelitian ini tidak dilakukan disebabkan oleh terbatasnya dana penelitian. Sedangkan perhitungan dengan menggunakan soft
ware curve expert menunjukkan hasil yang terlalu tinggi mencapai 3-4 kali lipat bahkan untuk kadar leptin bagi responden yang berada pada katagori normal. Perbandingan hasil perhitungan ketiga metode ini dapat dilihat pada tabel dibawah ini.
No Sampel
Katagori Perhitungan
Soft Ware PLA Manual
1 Normal 17.78 10.5 4.68
2 Overweight 33.28 16.5 9.25
3 Obesitas 42.36 25.00 12.08