BAB IV METODOLOGI PENELITIAN
4.8 Prosedur Penelitian
mikroskop cahaya binokuler merk Olympus tipe CX 21, mulai dari pembesaran lemah (40x) kemudian pembesaran sedang (400x) dan pembesaran kuat (1000x). Penghitungan dilakukan pada seluruh sel tumor dimulai dari bagian tumor dengan ekspresi ER terkuat ke bagian yang lebih lemah. Interpretasi ekspresi ER dilakukan oleh peneliti dan seorang spesialis Patologi Anatomi. Sel yang mengekspresikan ER akan tampak berwarna coklat pada inti sel ganas. Penilaian ekspresi ER dibuat berdasarkan laporan standar Patologi tahun 2010 dan dikatakan positif apabila sama atau lebih dari 1 % sel tumor ganas invasif terpulas pada inti, dengan intensitas lemah, sedang dan kuat (Laporan Standar Patologi, 2010).
7. Kontrol positif adalah : Sediaan pemeriksaan IHK pasien karsinoma payudara duktal invasif tipe tidak spesifik dengan hasil pulasan IHK ER positif kuat pada inti sel ganas.
8. Kontrol negatif adalah : Sediaan pemeriksaan IHK pasien karsinoma payudara duktal invasif tipe tidak spesifik dengan hasil pulasan IHK ER negatif pada inti sel ganas.
4.8 Prosedur Penelitian
1. Sediaan penderita karsinoma payudara duktal invasif tipe tidak spesifik yang melakukan pemeriksaan histopatologi dari 1 Januari 2011 sampai dengan 31 Desember 2012 dikumpulkan dan dilihat apakah memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi.
2. Preparat hasil pulasan HE sesuai nomor-nomor diatas dikumpulkan dan dievaluasi ulang. Yang dinilai adalah parameter derajat diferensiasinya. Adapaun langkah-langkah teknik pewarnaan Harris’s hematoksilin dan eosin adalah sebagai berikut :
a. Deparafinisasi dengan dicelupkan pada xilol sebanyak 4 kali masing-masing celupan selama 5 menit.
b. Hidrasi dengan alkohol 95% sebanyak 4 kali, masing-masing celupan selama 2 menit.
c. Masukan ke air selama 10 menit.
d. Celupkan ke cat utama yaitu Harris’s hematoksilin selama 10 menit.
e. Cuci dengan air mengalir selama 20 menit.
f. Lihat dibawah mikroskop, inti sel akan terlihat biru terang sedangkan sitoplasma tidak berwarna.
g. Celupkan pada cat pembanding eosin 1% selama 0,5-1 menit. h. Dehidrasi dengan alkohol 95% sebanyak 3 kali, masing-masing
celupan selama 2 menit, selanjutnya menggunakan alkohol absolut selama 2 menit.
i. Penjernihan dengan xilol sebanyak 4 kali celupan, lama masing-masing celupan selama 5 menit.
j. Tutup dengan cover glass.
3. Memilih preparat yang akan dipulas IHK COX-2 dan ER. Preparat yang dipilih untuk pemeriksaan IHK COX-2 dan ER adalah preparat yang
42
paling banyak mengandung bagian tumor dengan area nekrosis yang sedikit atau tidak ada. Jika satu kasus mempunyai lebih dari satu sediaan yang mengandung tumor, maka dipilih sediaan yang mengandung bagian tumor dengan diferensiasi yang lebih jelek.
4. Preparat yang terpilih kemudian dicari blok parafinnya.
5. Blok parafin yang memenuhi kreteria inklusi dipotong setebal 4 mikrometer dengan mikrotom untuk pulasan IHK COX-2 dan ER. 6. Pulasan IHK untuk COX-2 dan ER menggunakan antibodi poliklonal
COX-2 dan ER dari Dako. Adapun prosedur pulasan IHK COX-2 adalah sebagai berikut :
a. Potong blok parafin menggunakan mikrotom Leica 2125 RM dengan ketebalam 3 µm, kemudian direkatkan pada gelas obyek yang telah dilapisi dengan poly-L-lysine, merk Sigma, dengan ukuran lebar 1 inchi, panjang 3 inchi dan tebal 1,2 mm.
b. Inkubasi dalam incubator dengan suhu 37o C selama 1 malam.
c. Deparafinisasi dengan xylol, preparat dicelupkan ke dalam xylol sebanyak 3 kali, masing-masing celupan selama 3 menit.
d. Rehidrasi dengan alkohol bertingkat terdiri dari alkohol absolute 2 ali, alkohol 95%, alkohol 80%, dan alkohol 70%, masing-masing selama 3 menit.
f. Teteskan H2O2 dalam methanol 3% sampai menutupi seluruh permukaan jaringan selama 15 menit.
g. Cuci dengan aquadest selama 10 menit.
h. Cuci dengan PBS (phosphate buffer saline) sebanyak 2 kali, masing-masing selama 10 menit.
i. Rendam dengan buffer sitrat 0,01 M, pH 6,0. Kemudian panaskan di dalam oven microwave selama 15 menit, mula-mula dengan pemanasan tinggi (80oC) sampai tepat mendidih kemudian dengan pemanasan sedang (50oC) selama 5 menit.
j. Dinginkan pada suhu kamar.
k. Cuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 10 menit.
l. Tteskan 100µl selama 10 menit.
m. Teteskan 100 µl antibody primer menggunakan antibody monoclonal COX-2 dari Dako yang telah diencerkan (pengenceran 1:100) selama 30 menit pada suhu kamar atau semalam pada suhu 40C.
n. Cuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 10 menit.
o. Teteskan Biotinylated Anti Polyvalent selama 10 menit.
p. Cuci dengan BS sebanyak 2 kali, masing-masing 10 menit.
44
r. Cuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 10 menit.
s. Teteskan dengan reagen DAB selama 10 menit.
t. Cuci dengan air mengalir.
u. Counterstain dengan Mayer Hematoksilin selama 2 menit.
v. Cuci dengan air mengalir.
w. Dehidrasi dengan alkohol bertingkat terdiri dari alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 95%, dan alkohol absolut 2 kali, masing-masing selama 3 menit.
x. Celupkan ke dalam xylol sebanyak 3 kali, masing-masing selama 3 menit.
y. Tutup dengan cover glass.
Prosedur pulasan IHK ER adalah sebagai berikut :
a. Potong blok parafin menggunakan mikrotom Leica 2125 RM dengan ketebalam 3 µm, kemudian direkatkan pada gelas obyek yang telah dilapisi dengan poly-L-lysine, merk Sigma, dengan ukuran lebar 1 inchi, panjang 3 inchi dan tebal 1,2 mm.
b. Inkubasi dalam incubator dengan suhu 37o C selama 1 malam.
c. Deparafinisasi dengan xylol, preparat dicelupkan ke dalam xylol sebanyak 3 kali, masing-masing celupan selama 3 menit.
d. Rehidrasi dengan alkohol bertingkat terdiri dari alkohol absolute 2 kali, alkohol 95%, alkohol 80%, dan alkohol 70%, masing-masing selama 3 menit.
e. Cuci dengan aquadest selama 10 menit.
f. Teteskan H2O2 dalam methanol 3% sampai menutupi seluruh permukaan jaringan selama 15 menit.
g. Cuci dengan aquadest selama 10 menit.
h. Cuci dengan PBS (phosphate buffer saline) sebanyak 2 kali, masing-masing selama 10 menit.
i. Rendam dengan buffer sitrat 0,01 M, pH 6,0. Kemudian panaskan di dalam oven microwave selama 15 menit, mula-mula dengan pemanasan tinggi (80oC) sampai tepat mendidih kemudian dengan pemanasan sedang (50oC) selama 5 menit.
j. Dinginkan pada suhu kamar.
k. Cuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 10 menit.
l. Tteskan 100µl selama 10 menit.
m. Teteskan 100 µl antibody primer menggunakan antibody monoclonal ER dari Dako yang telah diencerkan (pengenceran 1:100) selama 30 menit pada suhu kamar atau semalam pada suhu 40C.
46
o. Teteskan Biotinylated Anti Polyvalent selama 10 menit.
p. Cuci dengan BS sebanyak 2 kali, masing-masing 10 menit.
q. Teteskan Streptavidin Peroxidase selama 10 menit.
r. Cuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 10 menit.
s. Teteskan dengan reagen DAB selama 10 menit.
t. Cuci dengan air mengalir.
u. Counterstain dengan Mayer Hematoksilin selama 2 menit.
v. Cuci dengan air mengalir.
w. Dehidrasi dengan alkohol bertingkat terdiri dari alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 95%, dan alkohol absolut 2 kali, masing-masing selama 3 menit.
x. Celupkan ke dalam xylol sebanyak 3 kali, masing-masing selama 3 menit.
y. Tutup dengan cover glass.
7. Pemeriksaan pulasan IHK COX-2 dan ER dengan mikroskop merk
Olympus tipe CX 21.
8. Pencatatan dan pengumpulan data. 9. Analisis data.
Gambar 5. Bagan Alur Penelitian
Gambar 4.2 Prosedur penelitian