METODE PENELITIAN
3.4 Prosedur Penelitian .1 Persiapan.1 Persiapan
Peralatan dan bahan disiapkan terlebih dahulu. Adapun bahan yang disiapkan berupa buah D. lasianthera J.J. Smith yang berumur 4 bulan. Semua peralatan serta media yang akan digunakan juga dipersiapkan. Bahan-bahan penyusun media Vacin and Went (VW) yang dipersiapkan adalah :
a. Pembuatan stok mikronutrien dalam 100 mL (100 kali konsentrasi)
Pembuatan larutan stok mikronutrien 100 X (100 kali konsentrasi) dalam 100 mL yaitu dengan cara menimbang setiap bahan penyusun mikronutrien dengan menggunakan timbangan analitik. Bahan-bahan tersebut dimasukkan satu persatu ke dalam Erlenmeyer 250 mL yang berisi 80 mL akuades steril. Setiap bahan kimia yang dimasukkan diaduk dengan magnetic stirrer sampai warna larutan menjadi jernih. Setelah semua bahan larut dengan sempurna, ditambahkan akuades steril hingga volumenya sampai 100 mL sambil diaduk terus hingga semua bahan larut, kemudian larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan diberi label “Mikro VW 100X (1 mL/L)” kemudian disimpan dalam lemari es. b. Pembuatan stok zat besi dalam 200 mL (40 kali konsentrasi)
Pembuatan larutan stok zat besi 40 X (40 kali konsentrasi) dalam 200 mL yaitu dengan cara menimbang FeSO47H2O dan Na2EDTA 40 kali berat sesungguhnnya menggunakan timbangan analitik. Kedua bahan tersebut
dilarutkan dalam 75 mL akuades secara terpisah. Larutan yang berisi FeSO47H2O dipanaskan hingga hampir mendidih, kemudian larutan Na2EDTA dimasukkan secara perlahan sambil diaduk dan dipanaskan diatas hot plate magnetic stirrer hingga warna larutan menjadi kuning jernih. Kemudian larutan ditambah dengan akuades hingga mencapai volume 200 mL. Selanjutnya mulut erlenmeyer ditutup dengan alumunium foil dan diberi label “Zat Besi VW 40X (5 mL/L)” lalu disimpan dalam lemari es. Untuk pembuatan 1 L media VW, ditambahkan 5 mL stok zat besi.
c. Pembuatan stok vitamin dalam 200 mL (50 kali konsentrasi)
Pembuatan larutan stok vitamin 200 mL dengan menimbang setiap bahan kimia penyusun vitamin menggunakan timbangan analitik. Satu persatu bahan-bahan tersebut dimasukkan dan dilarutkan dalam Erlenmeyer 200 mL yang berisi aquades steril 150 mL sambil diaduk menggunakan magnetic stirrer. Setelah semua bahan larut kemudian ditambahkan aquades sampai 200 mL sambil terus diaduk. Kemudian ditutup dengan aluminium foil dan diberi label “VITAMIN VW 50X (4 mL/L)”. Setelah itu di simpan di kulkas dan untuk pembuatan medium 1 L medium VW memerlukan 4 mL stok vitamin.
d. Pembuatan media VW modifikasi (Vacin dan Went) 1 liter
Pembuatannya dilakukan dengan cara menimbang senyawa makronutrien satu persatu dan melarutkannya ke dalam 500 mL aquades sambil dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer (Lampiran 1). Kecuali bahan kimia kalsium phospate ( )2 harus dilarutkan terlebih dahulu dengan HCl karena ( )2sukar larut dalam air.
Selanjutnya ditambahkan stok mikronutrien dan stok zat besi sambil diaduk menggunakan magnetic stirer. Mio-inositol dan sukrosa ditimbang lalu dimasukkan. Apabila semua bahan telah terlarut maka ditambahkan akuades hingga volume mencapai 1 liter. Kemudian dibagi dalam 5 botol Erlenmeyer sesuai perlakuan. Setiap perlakuan berisi 200 mL. Agar-agar ditimbang dan dimasukkan kedalam media.
Selanjutnya pH diukur dengan menggunakan kertas pH. Ukuran pH media adalah 5,6-5,8, bila terlalu asam maka ditambahkan beberapa tetes NaOH 1N dan apabila terlalu basa maka ditambahkan HCl 1N dengan menggunakan pipet sampai diperoleh pH yang sesuai. Kemudian di tambah ekstrak yeast sesuai perlakuan (0 g/L, 0,5 g/L, 1 g/L, dan 1,5 g/L, 2 g/L). Setelah itu, untuk perlakuan K, tidak diberi ekstrak yeast. Selanjutnya, larutan media diaduk dan dipanaskan diatas hot plate sampai mendidih. Larutan yang sudah jadi dituang ke dalam botol kultur.
Dalam keadaan masih cair, media dibagi dalam botol kultur ±20 mL/botol. Kemudian, botol kultur yang telah berisi larutan media selanjutnya ditutup dengan alumunium foil dan diberi label sesuai dengan perlakuan. Setelah itu, media
disterilkan dalam autoklaf pada suhu 1210C dan tekanan 1 atm selama 15 menit, kemudian disimpan dalam ruang inkubasi.
e. Pembuatan larutan ekstrak yeast
Pembuatan larutan ekstrak yeast dimulai dengan menimbang ekstrak yeast sebanyak 0 g/L, 0,5 g/L, 1 g/L, dan 1,5 g/L, 2 g/L. Kemudian ekstrak yeast yang
sudah di timbang dimasukkan kedalam botol erlenmyer yang berisi larutan VW. Lalu di homogenkan menggunakan stirrer hinggal larut.
f. Pembuatan ekstrak buah pisang
Ekstrak buah pisang didapatkan dengan cara menghaluskan buah pisang raja dengan blender, kemudian dibagi sesuai dengan perlakuan ( 25 g/L, 50 g/L, 75 g/L).
3.4.2 Sterilisasi
a. Sterilisasi alat
Alat-alat yang digunakan yaitu pinset, spatula, scalpel, cawan petri dicuci bersih dengan sabun pencuci dan dibilas dengan air kran, kemudian dikeringkan. Alat-alat tersebut dibungkus dengan kertas payung (kertas coklat) dan direkatkan dengan selotip. Semua peralatan tersebut dimasukkan ke dalam autoklaf pada suhu 1210 C dan tekanan 1 atm selama 20 menit. Setelah disterilkan, semua peralatan tersebut disimpan dalam oven sebelum digunakan untuk penanaman eksplan. b. Sterilisasi bahan tanam
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji anggrek yang masih terbungkus oleh kulit buah anggrek, oleh karena itu metode sterilisasi yang digunakan adalah metode secara mekanis. Prasterilisasi yang perlu dilakukan adalah buah anggrek direndam dalam air sabun selama 10 menit, kemudian dibilas dengan air mengalir hingga bersih. Setelah itu buah anggrek direndam dalam
larutan chlorox 20% selama 5-10 menit kemudian dibilas dengan akuades steril sebanyak 3 kali. Setelah presterilisasi, langkah selanjutnya adalah sterilisasi buah anggrek. Buah anggrek dicelup atau disemprot dengan alkohol 70% kemudian dilewatkan diatas api bunsen sebanyak 3 kali dan diulangi 3 kali.
c. Sterilisasi ruang kerja
Ruang kerja yang digunakan untuk penanaman adalah Laminar Air Flow (LAF). Untuk sterilisasi Laminar Air Flow (LAF) langkah yang
perlu dilakukan adalah menyiapkan kain lap dan alkohol 70% yang dimasukkan kedalam sprayer. Dinding dalam Laminar Air Flow (LAF) dibersihkan dengan kain lap yang telah dibasahi dengan alkohol 70% sampai merata. Setelah itu lampu UV yang terdapat pada Laminar Air Flow (LAF) dinyalakan selama 15 menit. Setelah itu,
lampu UV dimatikan dan diganti dengan lampu neon dan blower. Laminar Air Flow (LAF) siap digunakan.
d. Sterilisasi media
Media Vacin and Went yang telah diberi perlakuan di panaskan di atas kompor listrik, diaduk sampai mendidih. Setelah itu dimasukkan ke dalam botol kultur ± 20 mL dan di tutup dengan aluminium foil. Lalu dilakukan sterilisasi media menggunakan autoclave selama 15 menit pada suhu 1210 C dan tekanan 1 atm. Setelah 15 menit, ditunggu sampai tekanan pada autoclave menjadi 0 dan dikeluarkan dari autoclave dan selanjutnya diletakkan di dalam ruang kultur.
3.4.3 Tahapan Penelitian
Penelitian ini dilakukan melalui dua tahapan sebagai berikut : 1. Tahap Perkecambahan Biji
Penanaman eksplan biji D. lasianthera J.J. Smith dilakukan secara aseptis di dalam Laminar Air Flow (LAF). Semua alat, media dan bahan yang digunakan dimasukkan kedalam LAF. Api bunsen dinyalakan dan semua alat yang terbungkus kertas coklat dibuka. Petridish, scalpel, spatula, dan pinset disterilkan dengan melewatkannya diatas api bunsen.
Buah D. lasianthera J.J. Smith yang sudah disterilkan diletakkan diatas petridish steril dipotong melintang dan membujur menjadi 4 bagian
dengan menggunakan scalpel yang sudah terpasang dengan blade.
Biji dilepaskan dari buah menggunakan spatula (Parthibhan et al., 2012). Biji D. lasianthera J.J. Smith kemudian ditabur ke permukaan atas media VW modifikasi pada botol kultur untuk masing-masing perlakuan. Mulut botol kultur dan aluminium foil dipanaskan sebentar diatas api bunsen lalu botol kultur ditutup kembali dengan aluminium foil. Setiap botol kultur diinkubasi di dalam ruang inkubasi yang bersuhu 250C. Setelah itu dilakukan pengamatan perkembangan biji dari fase 0 sampai dengan fase 5. Pengamatan dilakukan pada minggu ke-4, minggu ke-8 dan minggu ke-12 setelah kultur. Pengamatan dilakukan dengan cara mengambil sampel dengan 5 titik yang berbeda dari botol kultur setiap perlakuan. Pengamatan ini dilakukan dibawah mikroskop binokuler dan stereo untuk mengetahui perkembangan embrio dari fase 0 sampai fase 5.