Bahan yang digunakan adalah tunikata Pyura sp dari pulau Samalona.
Sampel dicuci dengan akuabides lalu dikeringkan kemudian diserbukkan. Serbuk sampel Pyura sp. ditimbang sebanyak 5 gram lalu direbus dengan 100 mL akuabides hingga suhu mencapai 80–90oC. Sampel kemudian didinginkan dan disaring dengan menggunakan kertas Whatmann no. 1 untuk mendapatkan ekstrak sampel tunikata Pyura sp.
3.4.2 Uji Fitokimia
3.4.2.1 Uji Kandungan Tanin
2 mL ekstrak Pyura sp. ditambahkan beberapa tetes FeCl3. Terbentuknya endapan berwarna hijau menandakan adanya kandungan tannin.
3.4.2.2 Uji Kandungan Flavonoid
Ekstrak dimasukkan ke dalam dua tabung reaksi yang berbeda. Ekstrak dalam tabung reaksi yang pertama ditambahkan beberapa tetes timbal asetat (Pb(CH3COO)2). Terbentuknya endapan berwarna kuning menandakan adanya kandungan flavonoid. Sementara itu, ekstrak dalam tabung reaksi yang kedua ditambahkan beberapa tetes asam sulfat (H2SO4). Terbentuknya endapan berwarna
30 oranye menandakan adanya kandungan flavonoid (Santhi dan Sengotuvvel, 2016).
3.4.2.3 Uji Kandungan Saponin
Metode yang digunakan adalah uji Frothing. Sebanyak 2,5 mL ekstrak dicampur dengan beberapa tetes akuades lalu dikocok dengan kencang.
Terbentuknya busa dengan jumlah yang banyak menandakan adanya kandungan saponin (Ajuru dkk., 2017).
3.4.2.4 Uji Kandungan Steroid
2 mL anhidrida asetat ditambahkan ke dalam 5 mL ekstrak kemudian ditambahkan 2 mL asam sulfat secara perlahan. Terjadinya perubahan warna dari ungu menjadi biru atau hijau menandakan adanya kandungan steroid (Santhi dan Sengotuvvel, 2016).
3.4.2.5 Uji Kandungan Terpenoid
Metode yang digunakan adalah uji Salkowski. Sebanyak 2 mL kloroform (CHCl3) ditambahkan ke dalam 5 mL ekstrak kemudian ditambahkan 3 mL asam sulfat pekat (H2SO4) secara perlahan hingga terbentuk lapisan. Terbentuknya lapisan antarmuka berwarna merah (interface) menujukkan adanya kandungan terpenoid (Astuti dkk., 2011).
3.4.2.6 Uji Kandungan Alkaloid
3 mL HCl 1% ditambahkan ke dalam 3 mL ekstrak lalu diaduk di atas penangas. Campuran dimasukkan ke dalam 2 tabung reaksi yang berbeda masing-masing sebanyak 1 mL. Ekstrak dalam tabung reaksi yang pertama ditambahkan beberapa tetes reagen Dragendorff. Terbentuknya endapan berwana oranye
31 menandakan adanya kandungan alkaloid. Sementara itu, ekstrak dalam tabung kedua ditambahkan beberapa tetes reagen Mayer. Terbentuknya endapan berwarna krim kekuning-kuningan menandakan adanya kandungan alkaloid (Bargah, 2015).
3.4.3 Pembuatan Larutan HAuCl4 1000 ppm
Serbuk emas ditimbang sebanyak 1 gram kemudian dilarutkan dengan aquaregia. Setelah itu, larutan dimasukkan ke dalam labu ukur 1000 mL kemudian ditambahkan akuades hingga tanda batas lalu dihomgenkan.
3.4.4 Sintesis Nanopartikel
Optimasi konsentrasi larutan HAuCl4 dan komposisi dilakukan terlebih dahulu dalam sintesis nanopartikel emas.
Larutan HAuCl4 0,3 mM sebanyak 100 mL dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 250 mL kemudian diiaduk. Selanjutnya ditambahkan sebanyak 20 mL sampel ekstrak tunikata tetes demi tetes sambil diaduk hingga terjadi perubahan warna menjadi ungu lembayung. Larutan nanopartikel emas yang didapatkan, disentrifuse pada kecepatan 14000 rpm selama 15 menit pada suhu 26oC sebanyak 2-3 kali. Nanopartikel kemudian dibiarkan tumbuh selama 8 hari lalu disentrifuse kembali pada kecepatan 14000 rpm selama 30 menit pada suhu 26oC. Nanopartikel emas yang telah murni dikeringkan dalam freeze dryer pada suhu 4oC untuk selanjutnya karakterisasi (Hamed dan Givianrad, 2015).
3.4.5 Karakterisasi Nanopartikel Emas 3.4.5.1 Analisis Spektrofotometer UV-Vis
Karakterisasi hasil sintesis dilakukan dengan menggunakan instrumen spektrofotometer UV-2600 Shimadzu yang telah distandarisasi dengan
32 menggunakan larutan blanko, yang merupakan larutan HAuCl4 tanpa sampel tunikata. Larutan yang mengandung nanopartikel perak dimasukkan ke dalam kuvet kemudian dilakukan pengukuran pada panjang gelombang 200 – 700 nm (Patel dkk., 2016).
3.4.5.2 Analisis Particle Size Analyser (PSA)
Sampel larutan nanopartikel emas dimasukkan ke dalam kuvet sebanyak 3 mL. Kemudian kuvet dimasukkan ke dalam instrumen dan ditembakkan dengan sinar tampak sehingga terjadi difraksi.
3.4.5.3 Analisis spektroskopi Fourier-Transform Infrared
Sampel disiapkan sebanyak 2 mg , kemudian dicampur dengan 100 mg KBr dan dibuat pelet. Analisis spektrum FTIR dilakukan pada kisaran bilangan gelombang dari 4000 – 400 cm-1.
3.4.6 Persiapan Medium
a. Pembuatan Medium Nutrien Agar Miring
Nutrien Agar ditimbang sebanyak 5 g dan dimasukkan ke dalam gelas kimia, kemudian ditambahkan akuades sebanyak 250 mL. Setelah itu campuran dikocok dengan menggunakan stirer di atas penangas air dan diatur pH nya menjadi pH 7, kemudian nutrien agar tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak ± 5 mL, lalu disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit. Selanjutnya didinginkan pada suhu ruangan hingga memadat pada kemiringan 30o. Medium nutrien agar miring digunakan sebagai medium peremajaan bakteri uji (Lay, 1994).
b. Peremajaan Bakteri Uji
Bakteri uji Escherichia coli dan Staphylococcus aureus, yang berasal dari
33 biakan murninya, masing-masing diambil sebanyak 1 ose lalu diinokulasi dengan cara digores pada medium Nutrien Agar Miring secara aseptis, lalu diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37 oC selama 18-24 jam.
d. Pembuatan Larutan Kontrol Positif dan Kontrol Negatif
Larutan kontrol positif yang digunakan adalah larutan antibiotik ampicilin.
Ampicilin sebanyak 0,500 g dilarutkan dalam 20 mL akuabides, kemudian kertas cakram kosong direndam dalam larutan ampisilin selama 15 menit hingga kertas cakram menyerap larutan ampisilin. Selanjutnya cakram yang berisi ampisilin didiamkan selama 15 menit. Sedangkan untuk kontrol negatif digunakan cakram kosong steril.
e. Pembuatan media Mueller Hinton Agar (MHA)
Media MHA ditimbang sebanyak 7,6 gram kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Ditambahkan 200 mL akuades ke dalam erlemneyer kemudian dipanaskan sehingga mendidih. Setelah itu, media disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 ºC selama 15 menit. Media kemudian dibiarkan hingga suhu mencapai 45 ºC hingga 50 ºC kemudian dituangkan ke dalam cawan petri yang steril untuk digunakan.
3.4.7 Uji Bioaktivitas Antibakteri
Biakan bakteri pada media nutrien agar miring diswab merata pada permukaan media MHA yang terdapat pada cawan petri, kemudian dibiarkan selama 5 menit.
Nanopartikel emas sebanyak 7.2 mg dilarutkan dengan 2 mL akuabides yang sudah steril. Selanjutnya kertas cakram yang kosong yang berbeda direndam dalam larutan nanopartikel, ekstrak tunikata, HAuCl4 selama 15 menit. Kemudian
34 kertas cakram yang telah mengandung sampel diletakkan pada cawan petri steril selama 15 menit hingga tidak ada cairan yang menetes.
Selanjutnya kertas cakram yang telah berisi sampel diletakkan pada permukaan MHA ditekan sedikit hingga melekat. Setelah itu media MHA diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37 oC selama 2x24 jam. Diameter hambat yang terbentuk di sekitar lubang diamati. Terbentuknya diameter hambat di sekitar lubang menunjukkan adanya aktivitas antibakteri Escherichia coli dan Staphylococus aureus. Diameter hambat yang terbentuk di sekitar lubang diukur menggunakan jangka sorong (Mpila dkk., 2012).
35 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN