BAB III METODE PENELITIAN
D. Teknik Pengumpulan Data
2. Prosedur Penelitian
a. Prosedur Determinasi Tanaman 1) Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman dilakukan dahulu sebelum dilakukan penelitian untuk memastikan jenis dan kebenaran simplisia. Determinasi dilakukan di Laboratorium Fisiologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Mulawarman Samarinda.
2) Penyiapan Simplisia Daun Senggani
Daun senggani dikumpulkan kemudian dicuci bersih dengan air PDAM. Selanjutnya ditempatkan pada nampan. Pengeringan dilakukan dengan diangin-anginkan sampai kering di udara terbuka dan terlindung dari cahaya matahari langsung. Kemudian ditimbang berat kering simplisia daun senggani. Setelah simplisia kering, simplisia dihaluskan dengan menggunakan blender, lalu diayak dengan ayakan mesh 60. 3) Ekstraksi Daun Senggani
Ekstraksi daun senggani dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 70% sebanyak 5000 ml dengan 3x pengulangan (remaserasi). Sejumlah 500 gram serbuk
kering daun senggani dimasukkan ke dalam wadah kaca lalu direndam dengan pelarut etanol 70% selama 3x24 jam, setiap 1x24 jam pelarut diganti dan dilakukan pengadukan. Ekstrak cair yang didapat kemudian diuapkan di penangas air dan diperoleh ekstrak kental. Ekstrak yang diperoleh kemudian ditimbang kemudian dihitung jumlah rendemennnya.
4) Skrining Fitokimia Ekstrak Daun Senggani
Skrining fitokimia dilakukan terhadap simplisia dan ekstrak daun kerehau yang meliputi; pemeriksaan senyawa kimia golongan alkaloid, flavonoid, saponin dan tanin.
a) Pemeriksaan Alkaloid
Diambil 3 tabung reaksi, lalu masing-masing dimasukkan 0,5 ml ekstrak. Pada masing-masing tabung reaksi ditambahkan 2 tetes pereaksi mayer, bouchardat, dan dragendorff. Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan. Bila sedikitnya 2 dari 3 pereaksi di atas positif maka sampel mengandung alkaloid.
b) Pemeriksaan Flavonoid
Ekstrak diambil 5 ml lalu ditambahkan 0,1 g serbuk Mg dan 1 ml HCl pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Bila terbentuk warna kuning, orange atau merah pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid.
c) Pemeriksaan Saponin
Masukkan ekstrak kedalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan dan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Jika terbentuk buih yang banyak selama tidak kurang dari 10 menit, setinggi 1 cm sampai 10 cm dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin.
d) Pemeriksaan Tanin
Ekstrak diencerkan sampai hampir tidak berwarna, lalu ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi (III) klorida, jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin.
b. Prosedur Pengawetan 1) Sterilisasi
Disiapkan semua alat-alat yang akan disterilkan. Dimasukkan air ke dalam alat sterilisasi sampai dekat angsang (dasar yang berlubang-lubang tempat alat-alat yang disterilkan). Dibungkus alat-alat yang disterilkan. Dibungkus alat-alat gelas menggunakan kertas HVS atau kertas lain dan diikat menggunakan karet. Dimasukkan alat yang akan disterilkan ke keranjang besi dalam autoclave. Dipasang tutup autoclave dan sekrup dikeraskan. Dilakukan sterilisasi selama 15-30 menit dengan suhu 1210C
bertekanan 1 atm. Alat yang telah disterilisai dimasukkan kedalam incubator untuk menghindari kontaminasi mikroba.
2) Prosedur Pengawetan Sampel a) Tahap Persiapan
Diawali dengan diawali dengan pembelian daging sapi segar pada pasar Segiri Samarinda. Proses pembelian sampai dalam proses terkontrol, diantaranya dengan membungkus setiap potong daging sapi dalam plastik dan penyimpanannya dalam box steroform yang telah diberi es untuk mempertahankan suhu daging sapi. Daging sapi masing-masing sebanyak 50 g yang digunakan dalam penelitian ± 12 potong daging segar untuk 6 perlakuan. Sebanyak 2 potong daging digunakan untuk setiap perlakuan. Bahan-bahan dan alat juga disiapkan menurut tahapan penelitian agar tidak tertukar selama jalanannnya penelitian.
b) Tahap Perendaman
Daging sapi untuk setiap perlakuan, dalam tahap perendaman direndaman selama 3 menit, kecuali untuk daging sapi tanpa perlakuan konsentrasi ekstrak etanol 70% daun senggani. Waktu perendaman 3 menit merupakan waktu optimal untuk perendaman karena
tidak merusak aroma, warna dan penampakan, dengan nilai organoleptis. Setiap potongan daging sapi yang sudah direndam ditiriskan dengan menggunakan wadah saringan. Lalu setelah itu disimpan untuk tahapan selanjudnya.
c) Tahap Penyimpanan
Daging sapi yang sudah ditiriskan, kemudian disimpan dalam nampan toples kaca pada suhu ruang (25-30o) selama 12 jam dalam keadaan terbuka. Pengamatan untuk uji Total Plate Count (TPC) dan pewarnaan gram bakteri.
d) Pembuatan Larutan Uji
(1) Larutan natrium nitrit 0, 001%
Ditimbang natrium nitrit sebanyak 0,001 g kemudian dilarutkan dalam 100 ml
(2) Pembuatan larutan ekstrak
Ditimbang ekstrak daun senggani sebanyak 5 g, 10 g, 15 g dan 20 g kemudian masing-masing daun senggani dilarutkan dalam 100 ml aquades.
3) Pembuatan Media
a) Pembuatan Media LBA (Luria Bertani Agar) Disiapkan alat dan bahan yang diperlukan. Ditimbang media Pepton 1,5 g, NaCl 1,5 g,Yeast
Exstract 2,5 g, Agar 3,75 g dan dilarutkan dengan 250 ml aquadest dalam erlemeyer. Dimasukkan
magnetic stirrer ke dalam erlemeyer dan ditutup mulut erlemeyer menggunakan kapas, kassa dan
aluminium foil. Dimasukkan erlemeyer di atas hot plate dan dipanaskan hingga mendidih. Ditutup menggunakan kapas dan alumunium foil, kemudian distrerilisasikan dalam autoclave. Dikeluarkan dan dibiarkan hingga padat.
b) Pembuatan Media PCA (Plate Count Agar)
Disiapkan alat dan bahan yang diperlukan. Ditimbang media YE (Year Extract) sebanyak 2,12 g, media casein sebanyak 4,25 g, glukosa sebanyak 0,85 g, agar sebanyak 12,75 g. Dimasukkan bahan-bahan tersebut ke dalam erlemeyer dan dilarutkan dengan 800 ml aquadest. Dimasukkan magnetic stirrer ke dalam erlemeyer dan ditutup mulut erlemeyer menggunakan kapas, kassa, dan
alumunium foil. Diletakkan erlemeyer diatas hot
plate dan dipanaskan hingga mendidih.
Disterilisasikan media PCA menggunakan
c. Pengujian Hasil Pengawetan 1) Isolasi
Disiapkan semua alat dan bahan yang diperlukan. Ditimbang sampel (daging sapi) yang telah direndam dalam masing larutan sebanyak 0,5 g. Dibuka tutup aluminium foil pada mulut tabung reaksi pengenceran 10-1 yang berisi aquades dan dipanaskan mulut tabung di atas lampu bunsen. Dimasukkan daging sapi ke dalam tabung pengenceran 10-1 menggunakan spatula. Dipanaskan mulut tabung dan ditutup kembali menggunakan aluminium foil. Dihomogenkan dengan vortex.
Tutup mulut tabung pengenceran 10-2 dibuka dan dipanaskan mulut tabung di atas lampu bunsen. Diambil cairan dari tabung pengenceran 10-1 menggunkan mikropipet dan blutif, masukkan cairan tersebut ke dalam tabung tabung pengenceran 10-2. Dipanaskan mulut tabung di atas lampu bunsen ditutup menggunakan aluminium foil. Dihomogenkan dengan vortex. Dilakukan hal yang sama pada tabung pengenceran 10-3,10-4, 10-5 dan 10-6.
Tutup mulut tabung pengenceran dibuka dan dipanaskan mulut tabung di atas lampu bunsen. Diambil cairan dari tabung di atas lampu bunsen. Diambil cairan dari setiap tabung pengenceran menggunakan mikropipet dan
blutif. Dimasukkan cairan tersebut ke dalam cawan petri sebanyak 0,5 ml, dan ditambahkan dengan media PCA dan disebar secara merata. Dihomogenkan dengan menggeser cawan petri membentuk angka 8 sebanyak 20 kali. Setiap perlakuan pemindahan ke dalam media PCA ini dilakukan 2 kali ulangan. Diambil cairan dari tabung pengenceran menggunakan mikropipet dan blutif, masukkan cairan tersebut ke dalam tabung pengenceran. Dipanaskan mulut tabung diatas lampu bunsen dan ditutup menggunakan aluminium foil. Divortex hingga homogen. Dilakukan hal yang sama pada masing-masing tabung pengenceran.
Dilakukan inkubasi secara terbalik pada suhu 37o C selama 24 jam. Diamati dan dicatat bentuk koloni dari mikroba yang tumbuh yaitu bentuk koloni dari pengamatan secara vertikal maupun horizontal. Koloni yang tumbuh selama masa inkubasi, dihitung dan dinyatakan sebagai jumlah kolony forming unit (cfu) per gram atau koloni per gram. Dilakukan hal yang sama pada semua daging sapi yang direndam selama tiga hari berturut-turut (Anggraeni, 2012).
2) Pembuatan Biakan Murni
Disiapkan alat dan bahan yang diperlukan. Dibuka tutup kapas dan aluminium foil pada mulut tabung reaksi
yang berisi media LBA dan dipanaskan di atas lampu bunsen. Dipijarkan jarum ose. Diambil hasil isolasi (isolat) bakteri sebanyak 1 ose. Dilakukan streak pada media LBA dalam cawan petri. Dipanaskan mulut tabung reaksi di atas lampu bunsen. Ditutup kembali tabung reaksi menggunakan kapas dan aluminium foil. Diinkubsikan pada suhu 270C selama 24 jam. Diamati karakteristik tumbuhan koloni, perhatikan ada tidaknya kontaminasi (Killey, 2013).
3) Pewarnaan Gram Bakteri
Disiapkan semua alat dan bahan yang diperlukan. Dibersihkan object glass menggunakan alkohol sampai bebas lemak, kemudian difiksasi di atas lampu bunsen. Ditetesi dengan zat pewarna crystal violet 2-3 tetes, dan didiamkan selama 1 menit. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Ditetesi dengan cairan lugol dan dan dibiarkan selama 1 menit. Dicuci dengan dengan air mengalir dan dikeringkan. Dicuci dengan alkohol 95% selama 30 detik, kemudian dibilas dengan air mengalir dan dikeringkan. Diberi dengan larutan safranin, didiamkan selama 2 menit. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Ditutup dengan cover glass. Diamati di bawah mikroskop dan diidentifikasi jenis bakteri dari pewarnaan tersebut (James et al, 2008).