METODE PENELITIAN
3.3 Prosedur Penelitian .1 Uji Kadar Air Simplisia
1 gram kulit akar Ginseng Kuning segar dimasukkan dan ditimbang seksama dalam wadah yang telah ditara. Simplisia tersebut dikeringkan pada oven suhu 1050 C selama 30 menit, dibiarkan hingga suhu ruang dalam desikator, dan ditimbang. Pengeringan dilanjutkan dan ditimbang sampai perbedaan antara 2 penimbangan berturut-turut tidak lebih dari 0,001 g (Depkes, 2000).
3.3.2 Ekstraksi Kulit Akar Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Korth.)
Kulit akar Ginseng Kuning (Rennellia elliptica Kort.) segar sebanyak 259,94 gram ditimbang dan kemudian dirajang kecil. Hasil rajangan ini diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan etanol 96% yang telah didestilasi. Volume pelarut yang digunakan untuk maserasi adalah 600 mL yaitu sampai seluruh simplisia teremdam oleh pelarut. Simplisia direndam selama semalam (±24 jam). Proses ekstraksi ini dilakukan sebanyak lima kali dengan volume pelarut yang sama. Hasil maserasi disaring menggunakan kapas, dan selanjutnya disaring dengan kertas saring.
Filtrat yang diperoleh, pelarutnya diuapkan menggunakan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental yang kemudian dikeringkan dengan alat freez dryer selama 1 hari hingga diperoleh ekstrak kering sebanyak 19,7820 gram, dan selanjutnya dilakukan penghitungan persen rendemen ekstrak, yaitu:
3.3.3 Hewan Percobaan
Hewan percobaan (mencit) diaklimatisasi selama 10 hari terlebih dahulu sebelum diberikan perlakuan dengan ditempatkan dalam kandang pada suhu 230 C (±30 C). Hewan diberikan pellet untuk mencit dan air minum (ad libitum). Aklimatisasi dilakukan agar mencit dapat menyesuaikan diri dengan lingkungan. Selama proses aklimatisasi dilakukan pengamatan kondisi umum serta penimbangan bobot mencit.
3.3.4 Uji Toksisitas Akut
3.3.4.1Penentuan Nilai LD50 (OECD, 2008)
Penentuan nilai LD50 ini menggunakan metode Up and Down Procedure dengan uji batas dosis (limit test), dimana sebelum diberikan perlakuan, tiga mencit dipuasakan (tidak diberikan makan) terlebih dahulu selama 3-4 jam dengan tetap diberikan minum (ad libitum). Setelah dipuasakan mencit ditimbang dan kemudian satu mencit diberikan secara oral dosis tunggal ekstrak etanol kulit akar Ginseng Kuning dengan dosis 2000 mg/kgbb yang telah disuspensikan dalam Na CMC 1%. Volume Administrasi Obat (VAO) dihitung sesuai dengan bobot mencit, volume dosis tunggal yang diberikan pada mencit tidak lebih dari 1 ml/100 gram. Sedangkan 2 mencit yang lain digunakan sebagai kontrol. Untuk mencit kontrol hanya diberikan suspensi Na CMC 1% dengan volume pemberian sama dengan volume yang diberikan pada mencit yang diuji. Ketika sampel uji telah diberikan, mencit tidak diberikan makan (tetap diberikan minum) selama 1-2 jam, dan kemudian mencit diberikan makan kembali secara ad libitum. Mencit diamati setiap 30 menit selama 4 jam dan selanjutnya diamati setiap hari sampai 14 hari. Tanda-tanda toksisitas yang diamati meliputi, kulit dan bulu, mata, letargi (kelesuan), konvulsi (kejang), tremor (gemetar), diare, dan mati.
Dua hari berikutnya pengujian toksisitas ekstrak dilanjutkan pada empat mencit lain dengan perlakuan sebelum dan sesudah pemberian ekstrak sama seperti mencit sebelumnya. Pengujian ini dilakukan karena pada 48 jam setelah peberian ekstrak untuk mencit pertama masih hidup dan tidak menunjukkan tanda-tanda toksisitas ataupun kematian. Pengamatan bobot mencit dilakukan dengan menimbang bobot mencit setiap hari sampai hari ke 14.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 3.1 Perlakuan terhadap mencit
Mencit Perlakuan Ket
1 Ekstrak : 2000 mg/kgbb Mencit yang diberi perlakuan 2 Ekstrak : 2000 mg/kgbb 3 Ekstrak : 2000 mg/kgbb 4 Ekstrak : 2000 mg/kgbb 5 Ekstrak : 2000 mg/kgbb 6 Na CMC 1% Kontrol 7 Na CMC 1% 3.3.4.2Pengolahan Data a) Penghitungan LD50
Perhitungan LD50 menggunakan software AOT 425 StatPgm. b) Penghitungan Perbedaan Bobot Mencit
Data bobot mencit yang diperoleh diolah secara statistik menggunakan SPSS. Analisis yang dilakukan yaitu uji homogenitas dan uji kenormalan, selanjutnya dilakukan analisis varian one way ( ANOVA ) untuk melihat ada atau tidaknya perbedaan bermakna antara mencit yang diberikan perlakuan terhadap mencit kontrol.
3.3.5 Pengamatan Histopatologi Organ Mencit 3.3.5.1 Pengambilan Organ Mencit
Pemeriksaan histopatologi ini dilakukan untuk melihat pengaruh dari pemberian ekstrak etanol kulit akar Ginseng Kuning terhadap organ hati, ginjal, dan limpa mencit. Mencit yang masih bertahan hidup sampai hari ke 14, dimatikan dengan cara inhalasi menggunakan eter. Setelah mencit mati, kemudian dilakukan pembedahan untuk mengambil organ mencit. Pengambilan organ mencit dilakukan sebagai berikut:
a) Mencit yang telah mati ditelentangkan pada papan bedah.
b) Kulit perut bagian bawah diangkat dengan pinset, kemudian pada bagian tersebut digunting menggunakan gunting bedah untuk memberikan jalan bagi pembedahan.
c) Pengguntingan tersebut dilanjutkan kearah perut atas sisi kanan dan kiri hingga ke bagian bawah kedua kaki depan mencit sehingga seluruh bagian rongga perut mencit terlihat.
d) Organ yang diambil adalah hati, ginjal, dan limpa.
3.3.5.2 Pembuatan Preparat Histologi (Talukder, 2007)
a) Fiksasi Organ direndam dalam Buffer Neutral Formalin (BNF) 10% . b) Dehidrasi Organ yang telah difiksasi dalam BNF 10% di dehidrasi yaitu
dengan memotong organ kira-kira 1 cm kemudian direndam dalam alkohol bertingkat (alkohol 70%, 80%, 90%, 95%, dan-100%), masing-masing selama sehari.
c) Clearing Organ dibersihkan dengan diremdam dalam alkohol : xylen (3:1, 1:1, 1:3) masing-masing selama 30 menit, dan kemudian direndam dalam xylen selama sehari.
d) Infiltrasi Organ dimasukkan dalam xylen : paraffin (1:1) selama 30 menit, dan kemudian dimasukkan dalam paraffin 1,2, dan 3 masing-masing 1 jam. Proses ini dilakukan didalam oven dengan suhu 580 C.
e) Embedding Organ dimasukkan dalam cetakan yang sebelumnya telah diolesi dengan gliserol dan diisi dengan paraffin cair pada dasarnya. Organ yang akan diamati diletakkan melintang, kemudian paraffin cair dituang sampai cetakan penuh. Selanjutnya didiamkan pada suhu ruang selama sehari, sampai paraffin benar-benar mengeras, setelah itu didinginkan dalam lemari pendingin pada suhu 40 C.
f) Sectioning Hasil cetakan dipotong dengan menggunakan mikrotom dengan ketebalan 5 µm.
g) Afiksing Irisan yang diperoleh dari pemotongan tersebut diletakkan di atas gelas objek yang telah ditetesi air. Kemudian dikeringkan di atas hotplate dengan suhu ± 400 C selama ± 2 hari.
h) Staining Organ yang telah melekat pada gelas objek, direndam dalam xylen selama 1 jam, kemudian dilakukan rehidrasi dengan direndam dalam alkohol bertingkat (alkohol 100%, 95%, 90%, 80%, 70%) masing-masing selama ± 30 detik. Setelah itu direndam dalam aquadest. Kemudian
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta direndam dalam pewarna Hematoksilin selama ± 30 detik, selanjutnya dicuci pada air mengalir selama 15 menit. Setelah itu direndam dalam aquadest kembali. Dilanjutkan dengan direndam dalam pewarna eosin selama ± 30 detik dan kemudian direndam dalam alkohol bertingkat (alkohol 70%, 80%, 90%, 95%, dan 100%) masing-masing selama ± 30 detik. Setelah itu direndam dalam xylen selama 15-30 menit.
i) Mounting Preparat yang telah terwarnai ditetesi dengan entelan ± 1 tetes. Kemudian ditutp dengan cover glass.
j) Preparat diamati dibawah mikroskop cahaya untuk melihat organ secara mikroskopis dengan perbesaran 200 kali.
BAB 4