METODOLOGI PENELITIAN
3.7 Prosedur Pengambilan dan Pengumpulan Data .1 Prosedur Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Delima
Buah yang dipakai adalah buah yang segar, berwarna hijau kemerahan. (gambar 3). Bahan baku berupa buah delima sebanyak 5000 gram dicuci bersih, dibuang bijinya, dan diiris halus. (gambar 4) Kulit yang telah diiris ditimbang, didapat beratnya adalah 2170 gram. Selanjutnya kulit buah delima dikeringkan di lemari pengering selama 10 hari sampai dapat dipatahkan dengan rapuh ( gambar 5).
Sampel yang telah kering kemudian ditimbang kembali dan didapatkan berat 630 gram (gambar 6 dan 7), kemudian diblender sampai menjadi serbuk simplisia (gambar 8). Diayak dan ditimbang kembali dan didapatkan berat 250 gram (gambar 9). Simplisia kemudian dimasukkan ke dalam wadah dan dimaserasi selama 3 jam dengan pelarut etanol 70% dan diaduk sesekali (gambar 10). Setelah itu, dimasukkan ke dalam perkolator yang ditutup alumunium foil dan dibiarkan selama 24 jam dengan keadaan etanol cukup merendam sampel. Bagian ujung alat perkulator disumbat dengan kapas basah dan dilapisi kertas saring. Setelah 24 jam, bagian ujung
perkulator yang juga disambungkan pada tabung untuk menampung cairan dapat dibuka dengan kecepatan tetesan ±20 tetes/menit (gambar 11). Sampel pada tabung perkulator tetap dijaga dalam kondisi terendam etanol selama dilakukan penampungan perkolat. Prosedur penampungan perkolat dilakukan sampai perkolat yang dihasilkan jernih. Semua perkolat digabung dan disaring, lalu diuapkan dengan menggunakan Vaccum Rotary Evaporator pada tekanan < 1 ATM dengan temperatur ≤ 550
C. (gambar 12) Hasil akhir yang didapat adalah ekstrak kental kulit buah delima sebanyak 135 gram.(gambar 13)
Gambar 3. Buah delima segar Gambar 4. Kulit buah delima diiris
Gambar 5. Kulit delima dikeringkan Gambar 6. Kulit delima yang telah kering di lemari pengering
Gambar 8.Pemblenderan kulit delima
Gambar 10. Maserasi serbuk simplisia disertai pengadukan Gambar 9. Serbuk simplisia
ditimbang
Gambar 7. Penimbangan kulit delima kering
Gambar 13. Ekstrak kental kulit buah delima 3.7.2 Pengenceran Bahan Coba
Ekstrak kulit delima ditimbang menggunakan Electronic balance dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara dilarutkan dengan media Tryptic Soy Broth (TSB). Disediakan 6 buah tabung, pada tabung pertama diisi 1,25 gram ekstrak kulit buah delima dan dilarutkan dengan TSB hingga mencapai volume 5 ml. Kemudian dicampur dengan menggunakan vorteks sehingga Gambar 11. Serbuk kulit delima
yang direndam etanol di perkolator
Gambar 12. Proses penguapan etanol dan air dalam vacum rotary evaporator
diperoleh ekstrak kulit buah delima dengan konsentrasi 25%. Lima buah tabung yang lainnya kemudian diisi masing-masing 2,5 ml TSB. Selanjutnya dilakukan pengenceran dengan cara mengambil setengah dari ekstrak kulit buah delima konsentrasi 25% menggunakan mikropipet dan diletakkan pada tabung ke-2 untuk mendapatkan ekstrak kulit buah delima 12,5% (pengenceran ganda). Demikian seterusnya sampai didapatkan konsentrasi 6,25%, 3,125 %, 1,6125 %, dan 0,8%. Tabung-tabung tersebut kemudian diberi label sesuai konsentrasinya.
3.7.3 Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, dibuat media dengan melarutkan bubuk Tryptic Soy Agar sebanyak 20 gram ke dalam 500 ml aquadest untuk 40 petri (20 ml/petri). (gambar 14) Kemudian media disterilkan di dalam autoklaf selama 15-20 menit dengan tekanan udara 2 ATM, suhu 121o C. (gambar 15) Setelah disterilkan, media disimpan di dalam lemari pendingin. (gambar 16)
Gambar 15. Media disterilkan menggunakan autoklaf
Gambar 16. Media Tryptic Soy Agar yang telah selesai dibuat
3.7.4 Pembuatan Suspensi Bakteri
Kegiatan pembuatan suspensi bakteri menggunakan P. gingivalis ATCC 33277 yang telah dibiakkan secara murni pada media Tryptic Soy Agar (TSA) dalam suasana anaerob (gambar 17). Sebanyak 1-2 ose dari biakan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur disuspensikan dengan menggunakan larutan NaCl 0.9% sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar 0,5 Mc Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1 x 108 CFU/ml.
Gambar 17. P.gingivalis ATCC 33277 yang telah dibiakkan pada TSA
3.7.5 Pembuatan Kontrol Positif
Kontrol positif yang digunakan adalah suspensi bakteri yang telah disiapkan pada prosedur sebelumnya. Suspensi bakteri tersebut diambil sebanyak 2 ml dengan menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam microplate.
3.7.6 Pembuatan Kontrol Negatif
Kontrol negatif yang digunakan adalah ekstrak kulit buah delima tanpa suspensi bakteri. Ekstrak ini diambil sebanyak 2 ml dengan menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam microplate.
3.7.8 Penentuan KHM Bahan Coba
Bahan coba ekstrak kulit buah delima yang dipakai terdiri dari konsentrasi 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125 %, 1,6125 %, dan 0,8%. Dari masing-masing konsentrasi tersebut diambil sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam microplate reaksi kemudian diberi label sesuai konsentrasinya. Selanjutnya ambil 1 ml suspensi bakteri yang telah dipersiapkan sebelumnya dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing-masing microplate bahan coba yang telah diberi label kemudian dihomogenkan. Lalu tabung-tabung tersebut diinkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam pada inkubator CO2 dan diamati kekeruhan yang terjadi dengan membandingkan tabung-tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan nilai
KHM dari masing-masing bahan coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan KHM yaitu konsentrasi minimal ekstrak atau bahan uji apapun yang mampu menghambat pertumbuhan P.gingivalis
dalam media perbenihan setelah diinkubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni kuman dalam perbenihan tersebut.
3.7.9 Penentuan KBM Bahan Coba
Hasil prosedur penentuan nilai KHM, tidak terlihat larutan yang mulai tampak jernih, sehingga semua kelompok larutan dilanjutkan dengan perhitungan jumlah koloni bakteri, yaitu pada konsentrasi 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125 %, 1,6125 %, dan 0,8% dengan metode Drop Plate Miles Mesra. Bahan coba dengan konsentrasi tersebut masing-masing dihomogenkan dan diambil 50 µl untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam media padat Tryptic Soy Agar, dan direplikasi 4 petri, diamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan diinkubasi dalam inkubator CO2 dengan suhu 37o C selama 24 jam. Perhitungan jumlah koloni bakteri dilakukan menggunakan kaca pembesar dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri. Perhitungannya adalah bila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni. Satuan yang dipakai adalah CFU (Colony Forming Unit) / ml cairan (suspensi).
Setelah dihitung jumlah koloni pada masing-masing tetesan, kemudian dibuat jumlah rata-ratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal (sebelum dilakukan dilusi) maka faktor pengenceran x 1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50 µl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar (CFU/ml).
Contoh cara perhitungan koloni pada metode Drop Plate Miles Mesra :
a) Pada media padat ditetesi sebanyak 50 µl suspensi bahan coba dengan menggunakan mikropipet.
b) Kemudian dihitung jumlah koloni yang ada dengan menggunakan kaca pembesar dan didapatlah 5 koloni
c) Jadi jumlah bakteri pada bahan coba tersebut adalah : 5 x 1 (faktor pengenceran) x 20 (faktor pengali) = 100 CFU/ml
