Prosedur Percobaan

BAHAN DAN METODE

3.3 Prosedur Percobaan

3.3.1 Pemeliharaan Hewan Percobaan

Penelitian ini menggunakan mencit betina (Mus musculus L.) strain DDW. Disediakan satu ekor mencit jantan lalu dikawinkan dalam kandang yang berisi mencit betina yang sedang estrus selama satu malam. Bila ditemukan sumbat vagina maka

dinyatakan telah terjadi kopulasi atau perkawinan mencit antara mencit jantan dan mencit betina dan sebagai hari ke nol kehamilan (Taylor, 1986).

Kemudian mencit yang hamil dipisahkan dan dipelihara sampai melahirkan. Anak mencit yang berumur ± tiga minggu dipisahkan dari induknya dan dipelihara dalam kandang terpisah dengan memisahkan antara mencit jantan dan betina. Kandang yang terbuat dari plastik yang diberi alas sekam yang dilakukan pergantian sekam dua kali seminggu (Smith & Mangkoewidjojo, 1988). Pemberian pakan dan minum dilakukan setiap hari secara ad-libitum (Sabri, 2006). Bila mencit betina sudah berumur ± 12 minggu dengan kisaran berat badan ± 25-35 gram, mencit tersebut telah siap diberi perlakuan (Smith & Mangkoewidjojo, 1988).

Mencit betina yang telah siap diberi perlakuan tersebut dibagi dalam dua kelompok besar, yaitu kelompok pemberian selama masa pra implantasi 0-3 hari (Kelompok A) dan kelompok pemberian selama masa pasca implantasi 6-14 hari (Kelompok B). Masing-masing kelompok dibagi dalam 5 perlakuan, dengan masing-masing perlakuan terdiri atas 6 ekor mencit betina. Kemudian mencit betina tersebut dikawinkan dengan mencit jantan, jika sudah hamil maka diberi perlakuan ekstrak sesuai dengan kelompok pemberian masing-masing. Pemberian perlakuan terhadap hewan coba berpedoman pada prinsip-prinsip penelitian kesehatan yang menggunakan hewan secara etis, prosedur dan standart yang dibuktikan dengan Ethical Clearance dari Komite Etik Penelitian Hewan, FMIPA USU.

3.3.2 Pembuatan Bahan Uji

Buah andaliman disiapkan dengan mengumpulkan dan diseleksi. Kemudian dipisahkan dari tangkainya lalu dikeringkan dalam suhu kamar sampai kering. Buah yang telah kering diblender hingga menjadi simplisia (serbuk). Selanjutnya dibuat ekstrak dengan metode maserasi dengan N-Heksan selama 1 malam (Padmawinata et al., 1989 dalam Sabri, 1996). Hasil maserasi diperkolasi sampai diperoleh cairan bening. Hasil perkolasi dipekatkan dengan evaporator sampai diperoleh ekstrak yang

pekat berupa pasta. Ekstrak andaliman tidak larut dalam air, maka untuk mendapat campuran yang homogen digunakan suatu pelarut yaitu carboxyl metil cellulosa (CMC) dengan konsentrasi 1%. Lalu dibuat dosis yang telah dimodifikasi yaitu 2%, 4% dan 6% yang dilarutkan dalam 1% CMC (Pratiwi, 2006).

3.3.3 Pemberian Perlakuan

Pemberian bahan uji dilakukan pada mencit betina (Mus musculus L.) strain DDW yang sedang hamil dengan menggunakan jarum gavage (Hrapkiewicz & Medina, 2007). Pemberian dilakukan selama masa pra implantasi 0-3 hari kebuntingan dan masa pasca implantasi 6-14 hari kebuntingan. Volume pemberian ekstrak sebanyak 0,3 ml/mencit/hari. Kemudian mencit dibunuh dengan cara dislokasi leher pada saat mencapai 18 hari kebuntingan. Selanjutnya mencit dibedah, diambil organ hati dan dicuci dalam larutan fisiologis (NaCl 0,9%) lalu ditimbang, setelah itu dimasukkan ke dalam larutan Bouin.

3.3.4 Rancangan Penelitian

Metode yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah eksperimen dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL) non faktorial yang terdiri dari 2 kelompok berdasarkan perbedaan konsentrasi dan interval waktu pemberian perlakuannya, yaitu kelompok A (pemberian selama pra implantasi 0-3 hari) dan kelompok B (pemberian selama pasca implantasi 6-14 hari). Masing-masing kelompok terdiri atas 5 perlakuan, yaitu 3 perlakuan ekstrak (Perlakuan P1, P2, dan P3) dan 2 perlakuan kontrol (K0 dan KP). Dapat dilihat dalam Tabel 3.3.5, sebagai berikut:

Tabel 3.1 Model Rancangan Penelitian Kelompok

Perlakuan ^{Kelompok A}

Pra Implantasi 0-3 Hari

Kelompok B

Pasca Implantasi 6-14 Hari

Kontrol Blank K0A K0B

Kontrol Pelarut CMC 1% KPA KPB

Perlakuan Ekstrak N-Heksan 2% PA₁ PB₁

Perlakuan Ekstrak N-Heksan 4% PA2 PB2

Jumlah ulangan untuk setiap kelompok ditentukan dengan menggunakan rumus Federer (Chairul et al.,1992) yaitu:

(t - 1) (n - 1) ≥ 15

T = jumlah perlakuan N = jumlah ulangan

Pada kelompok pra implantasi 0-3 hari dan pasca implantasi 6-14 hari, tiap perlakuan ekstrak maupun perlakuan kontrol masing-masing terdiri dari enam ulangan sehingga mencit yang digunakan berjumlah 2 x 5 x 6 = 60 ekor. Perlakuan terdiri atas satu faktor yaitu perbedaan konsentrasi. Penentuan konsentrasi berdasarkan penelitian Chairul et al. (1992) yang telah dimodifikasi.

K0 = Kelompok kontrol blank tanpa perlakuan

KP = Kelompok kontrol pelarut dengan menggunakan pelarut CMC 1% (1 gram CMC/100 ml aquadest)

P₁ = Kelompok perlakuan dengan ekstrak N-heksan andaliman 2% (2 gram ekstrak kental/100 ml pelarut CMC 1%)

P₂ = Kelompok perlakuan dengan ekstrak N-heksan andaliman 4% (4 gram ekstrak kental/100 ml pelarut CMC 1%)

P₃ = Kelompok perlakuan dengan ekstrak N-heksan andaliman 6% (6 gram ekstrak kental/100 ml pelarut CMC 1%)

3.3.5 Pembuatan Preparat Hati Mencit Betina dengan Metode Parafin

Pembuatan preparat yang dilakukan dengan metode parafin (Suntoro, 1983) sebagai berikut:

a. Fiksasi

Mencit (Mus musculus L.) strain DDW didislokasi dan dibedah. Diambil organ hati, ditimbang dan dicuci dengan larutan NaCl 0,9% kemudian difiksasi selama 1 malam dengan larutan Bouin.

b. Washing (Pencucian)

Setelah difiksasi, hati dicuci dengan alkohol 70% dengan cara dishaker sampai benar-benar jernih dan direndam dengan alkohol 70 % selama 1 malam.

c. Dehidrasi

Dehidrasi dilakukan dengan merendam organ hati sambil dishaker dengan menggunakan alkohol bertingkat, yaitu dari alkohol 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 96% dan 100% (absolut) selama 1 jam pada masing-masing konsentrasi. d. Clearing (Penjernihan)

Clearing dilakukan dengan merendam hati ke dalam xylol selama 1 malam. e. Infiltrasi

Infiltrasi dilakukan dengan merendam hati ke dalam xylol selama 1 jam pada suhu kamar kemudian dipindahkan lagi ke dalam xylol yang baru yang berada di dalam oven pada suhu 56⁰C selama 1 jam. Lalu dilanjutkan lagi dengan merendam hati ke dalam parafin murni I, II, III masing-masing selama 1 jam pada suhu 56⁰C, yang selama proses pengerjaannya dilakukan dalam oven.

f. Embedding (Penanaman)

Embedding dilakukan dengan meletakkan hati pada kotak berbentuk segi empat yang telah dipersiapkan sebelumnya sebagai cetakan. Setelah itu, dituang parafin yang telah cair ke dalam kotak tersebut, kemudian hati ditanam dalam kotak yang telah berisi parafin dan diatur posisinya lalu diberi label. Dibiarkan sampai dingin sehingga membentuk blok parafin dan dimasukkan ke dalam freezer. Kemudian blok-blok tersebut dirapikan dan dilakukan penempelan blok-blok parafin pada holder yang terbuat dari kayu berukuran 1x1 cm yang berbentuk persegi.

g. Cutting (Pemotongan)

Cutting dilakukan dengan memotong blok-blok parafin yang telah diholder pada mikrotum sehingga membentuk pita-pita parafin dengan ukuran ketebalan 6 µm. h. Attaching (Penempelan)

Attaching dilakukan dengan mengambil beberapa pita parafin, kemudian diletakkan pada object glass, dan dicelupkan pada air dingin dan kemudian pada air hangat. Lalu diletakkan di atas hotplate beberapa detik untuk melekatkan pita parafin pada object glass dan membersihkan sebagian parafin yang melekat pada organ.

i. Deparafinasi, dilakukan dengan cara mencelupkan objek pada xylol sampai parafin habis kira-kira selama 5 menit.

j. Dealkoholisasi, dilakukan dengan mencelupkan objek glass ke dalam alkohol bertingkat ke alkohol konsentrasi menurun, yaitu dari alkohol 100% (absolut),

k. 96%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% dan kemudian ke dalam aquadest. Dimana masing-masing konsentrasi dicelupkan ± 3-5 detik.

l. Pewarnaan

Pewarnaan sediaan hati diwarnai dengan menggunakan Hematoxylin Eosin. Pewarnaan dilakukan dengan cara preparat yang telah dilekatkan pada object glass dimasukkan ke dalam larutan pewarna Hematoxylin Erlich selama 3 menit, lalu dicuci dengan dengan air mengalir ± 2 menit, kemudian dimasukkan ke dalam alkohol 30%, 50%, 70%, lalu dimasukkan ke dalam larutan pewarna Eosin 0,5% dalam alkohol selama 3 menit, lalu dimasukkan ke dalam aquadest dan kemudian preparat dimasukkkan berturut-turut ke dalam alkohol 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 96%, dan alkohol 100% (absolut). Setelah itu, dikeringkan dengan kertas pengisap. Lalu preparat dimasukkan ke xylol.

m. Mounting

Mounting dilakukan dengan menutup preparat dengan canada balsam. Diusahakan supaya tidak terdapat gelembung udara.

n. Diberi label dan diamati degenerasi parenkimatosa, degenerasi hidrofik, dan nekrosis sel di bawah mikroskop.