Penulis lahir di Kota Bandung pada tanggal 14 September 1966. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara dari pasangan Bapak Drs. Mulyana Kaiin, MM (almarhum) dan Ibu Suryati Elia. Pendidikan sarjana ditempuh di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Bandung, lulus tahun 1991. Pada tahun 1995, penulis melanjutkan pendidikan S2 di Pasca Sarjana ITB dan lulus pada tahun 1998. Pada tahun 2008, penulis melanjutkan pendidikan S3 di Program Studi Biologi Reproduksi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Penulis sejak tahun 1992 bekerja di Pusat Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi LIPI (sekarang: Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI) sebagai peneliti di Kelompok Peneliti Reproduksi Ternak dan Kultur Sel Hewan sampai sekarang. Pada tahun 1994 penulis menikah dengan Ir. Harry Prabowo Nikodemus dan dikaruniai dua orang putri (Sarah Aryka dan Kezia Rachel).
Publikasi ilmiah yang sudah dan akan diterbitkan selama menempuh pendidikan di Program Studi Biologi Reproduksi, yaitu :
1. Djuwita I, Harlystiarini, Widyaputri T, Efendi A, Kaiin EM, Nurhidayat. 2010. Tingkat Pertumbuhan dan Analisa Protein Sel-sel Fibroblast Fetal Tikus Hasil Kultur In Vitro. Hemerazoa 1 (2) : 9-16.
2. Kaiin EM, Djuwita I, Yusuf TL, Setiadi MA. 2013. Konsentrasi, Kemurnian dan Viabilitas Sel Leydig Hasil Purifikasi dengan Gradien Nycodenz dan Kultur In Vitro. Jurnal Kedokteran Hewan Unsyiah 7(1): 75- 80. 2013.
3. Kaiin EM, Djuwita I, Yusuf TL, Setiadi MA. 2013. Development of In Vitro Culture of Rat Leydig Cells After Purification With Nycodenz Gradient. Open Journal of Animal Sciences 3 (4) : 299-304.
4. Kaiin EM, Djuwita I, Yusuf TL, Setiadi MA. Biological Analysis of Leydig Cells Conditioned Medium to Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. Submitted to Pakistan Veterinary Journal.
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kehidupan modern dewasa ini menyebabkan tingkat stress yang tinggi, sehingga menjadi salah satu faktor pemicu berkembangnya berbagai macam penyakit yang memerlukan penanganan khusus. Berbagai penyakit tersebut dapat menyerang berbagai organ yang bersifat degeneratif, termasuk kelainan reproduksi. Salah satu penyakit kelainan reproduksi yang ditakuti oleh laki-laki adalah rendahnya produksi kadar testosteron, sehingga mengurangi kejantanan pria. Hal ini karena kekurangan hormon testosteron di dalam tubuh jantan dapat menghambat proses spermatogenesis (Hardy et al. 1991), sehingga menyebabkan infertilitas.
Kegagalan reproduksi pada jantan seperti defisiensi hormonal, saat ini umumnya diatasi dengan cara pemberian suplemen hormon testosteron sintetis, tetapi terapi tersebut pada manusia dapat menyebabkan resiko jangka panjang seperti menyebabkan penyakit jantung koroner, retensi cairan, kanker prostat dan sebagainya (Gruennewald & Matsumoto 2003). Untuk itu, beberapa peneliti telah melakukan upaya terapi lainnya dengan menggunakan sel Leydig sebagai sumber sel penghasil hormon testosteron yang dapat ditransplantasikan ke dalam testis. Penggunaan sel Leydig sebagai terapi alternatif penghasil hormon testosteron membutuhkan sumber sel Leydig yang akan ditransplantasikan dalam jumlah yang memadai. Produksi galur (cell line) sel Leydig secara in vitro diharapkan sebagai upaya tersedianya sumber sel Leydig untuk digunakan dalam mengembangkan terapi alternatif pada kegagalan reproduksi akibat defisiensi hormonal.
Isolasi sel Leydig pada umumnya dilakukan menggunakan gradien Percoll, tetapi diketahui bahwa Percoll dapat dimetabolisme oleh sel Leydig sehingga dapat menurunkan viabilitas sel Leydig ketika dikultur. Oleh karena itu diperlukan metoda isolasi dan purifikasi yang lebih baik. Nycodenz merupakan gradien pemisah yang bersifat non toksik dan tidak dapat diabsorpsi oleh beberapa jenis sel mammalia serta dapat dengan mudah dihilangkan dari sampel sel dibandingkan dengan gradien pemisahan lain (Miller 2006).
Diketahui fungsi utama sel Leydig pada testis dewasa adalah memproduksi testosteron yang diperlukan pada proses spermatogenesis. Pengaturan spermatogenesis tergantung dari sistem hormon yang kompleks yang secara langsung memerlukan testosteron. Sekresi testosteron oleh sel Leydig diatur oleh hormon LH dari hipofisa dan merupakan bagian dari aksis hipotalamus- hipofisa-testis (Senger 2005, Yang et al. 2003). Sekresi testosteron tersebut tidak hanya berdasarkan aktivitas sel Leydig pada interstitial tetapi juga berdasarkan jumlah sel Leydig di dalam testis. Pada mamalia, fungsi sel Leydig melibatkan dua generasi sel yaitu pertama adalah populasi sel Leydig yang berkembang selama masa fetus. Sel Leydig pada tahap ini bertanggung jawab terhadap maskulinisasi sistem urogenital jantan (Habert et al. 2001).
Progenitor sel Leydig diduga merupakan stem cell mesenkimal karena mempunyai morfologi seperti sel yang terdapat pada jaringan ikat yang berasal dari mesoderm embrio (Hardy et al 1991). Pada tikus, progenitor sel Leydig mempunyai kemampuan proliferasi tinggi dan menunjukkan marker fungsi diferensiasi (Ge et al. 2005). Disisi lain hormon LH atau hCG sangat diperlukan untuk proliferasi dan diferensiasi sel Leydig (Saez 1994) sehingga sel Leydig mampu memproduksi testosteron. Proliferasi sel Leydig di dalam kultur secara in vitro memerlukan bahan bioaktif tambahan dan yang umum digunakan adalah ITS (Insulin Transferrin Sodium Selenite) yang mengandung tiga faktor pertumbuhan. Selain itu juga berfungsi mengurangi penggunaan serum di dalam medium kultur.
Sel-sel yang dikultur secara in vitro mampu mensekresikan berbagai bahan bioaktif seperti faktor pertumbuhan (growth factor) yang bermanfaat bagi pertumbuhan sel dalam kultur. Kultur sel Leydig diduga mensekresikan berbagai bahan bioaktif seperti peptida, faktor pertumbuhan, hormon testosteron ke dalam medium kultur (Chemes et al. 1992, Cudicini et al. 1997, Hu et al. 1998). Medium tersebut dapat digunakan untuk mengkultur kembali sel Leydig maupun sel yang lain dan dikenal sebagai conditioned medium. Penggunaan conditioned medium ditemukan dapat mengarahkan diferensiasi stem cell mesenkimal menjadi sel tertentu (Djuwita et al. 2010), selain itu stem cell mesenkimal sumsum tulang belakang yang ditransplantasikan ke dalam testis menyebabkan sel tersebut berdiferensiasi menjadi sel Leydig (Yazawa et al. 2006).
Berdasarkan beberapa hal yang telah diuraikan di atas, maka perlu dilakukan penelitian untuk mendapatkan teknik isolasi dan pemurnian sel Leydig yang mempunyai viabilitas sel setelah kultur yang tinggi sehingga diperoleh galur sel sebagai sumber sel Leydig, untuk mendapatkan sistem kultur sel Leydig yang optimum, serta untuk mendapatkan sel Leydig alternatif dari stem cell mesenkimal yang diferensiasinya diarahkan dengan menggunakan conditioned medium kultur sel Leydig (transdiferensiasi).
Tujuan Penelitian
1. Menguji efektivitas gradien Nycodenz dalam meningkatkan konsentrasi, kemurnian dan viabilitas sel Leydig setelah diisolasi, dipurifikasi dan kultur in vitro.
2. Menguji pengaruh penambahan hCG dan/atau ITS ke dalam medium DMEM terhadap proliferasi dan perkembangan sel untuk mendapatkan kondisi optimum kultur in vitro sel Leydig hasil purifikasi dengan gradien Nycodenz.
3. Mengidentifikasi sekresi testosteron dan protein yang terdapat dalam conditioned medium (CM) kultur sel Leydig.
4. Memperoleh sel Leydig dari hasil kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang dengan CM kultur sel Leydig.
Manfaat Penelitian
Sel Leydig dan CM kultur sel Leydig dapat digunakan untuk aplikasi terapi reproduksi pada manusia dan hewan terutama hewan yang terancam punah.
Kerangka Pemikiran
Penggunaan gradien Percoll banyak digunakan untuk melakukan purifikasi sel Leydig berdasarkan densitas sel. Percoll terdiri dari silica koloid yang dilapisi oleh polyvinylpyrrolidone (PVP) dan merupakan medium yang mempunyai partikel dengan diameter 15-30 nm. Keuntungan penggunaan gradien Percoll adalah untuk memisahkan sel karena mempunyai viskositas, osmolaritas dan toksisitas yang rendah. Namun penggunaan Percoll untuk mempurifikasi sel Leydig ditemukan bersifat toksik terhadap sel karena adanya proses pinositosis sehingga partikel Percoll dapat masuk ke dalam sel Leydig.
Oleh karena itu, diperlukan gradien lainnya yang digunakan untuk mengatasi masalah toksisitas sel Leydig setelah purifikasi. Di samping itu, gradien alternatif yang digunakan untuk purifikasi sel Leydig juga harus menghasilkan kemurnian yang tinggi. Gradien non toksik Nycodenz yang merupakan gradien non partikel sudah sering digunakan untuk memperoleh berbagai jenis sel. Nycodenz atau iohexol bersifat non ionik dan non toksik serta tidak dimetabolisme oleh sel. Lebih lanjut diketahui juga bahwa Nycodenz merupakan larutan non partikel, sehingga mudah dihilangkan dari medium setelah digunakan untuk memisahkan sel. Purifikasi sel dengan gradien Nycodenz dilakukan dengan cara sentrifugasi sehingga sel dengan densitas tertentu akan berada pada konsentrasi gradien Nycodenz tertentu. Penggunaan gradien Nycodenz untuk mempurifikasi Leydig diharapkan dapat memperoleh tingkat kemurnian sel Leydig yang tinggi dan setara dengan penggunaan gradien Percoll.
Kultur sel Leydig yang optimal memerlukan berbagai bahan bioaktif yang mampu mendukung proliferasi dan perkembangan sel di dalam kultur. Produksi hormon testosteron oleh sel Leydig diatur oleh hormon gonadotropin yaitu hormon LH yang diperlukan oleh sel Leydig sebagai induktor untuk memproduksi testosteron secara in vivo. Di dalam kultur in vitro, penambahan hormon hCG yang merupakan analog dari LH digunakan untuk menginduksi sel Leydig dalam memproduksi testosteron. Di samping hormon, diduga bahwa untuk proliferasi sel diperlukan penambahan faktor pertumbuhan yang dapat mendukung proliferasi sel dengan baik. Faktor pertumbuhan ITS merupakan faktor yang berperan dalam proliferasi sel. Untuk itu kajian penambahan hCG atau ITS ke dalam medium kultur sel Leydig secara in vitro dilakukan untuk dapat meningkatkan konsentrasi sel serta memperoleh testosteron dan bahan bioaktif lainnya .
Sel Leydig dewasa berasal dari progenitor sel Leydig yang merupakan stem cell mesenkimal yang terdapat di dalam testis. Untuk pembuktian lebih
lanjut tentang kemampuan sekreta bahan bioaktif yang dihasilkan oleh kultur sel Leydig, maka dilakukan penelitian kemampuan conditioned medium sel Leydig untuk mengarahkan diferensiasi stem cell mesenkimal sumsum tulang menjadi sel Leydig. Untuk mencapai hasil di atas, maka dilakukan serangkai penelitian dalam tiga tahap, yaitu : (1) isolasi dan purifikasi sel Leydig menggunakan gradien Nycodenz, (2) optimasi medium kultur sel Leydig serta memperoleh conditioned medium serta galur sel Leydig dan (3) mengkultur stem cell mesenkimal sumsum tulang dengan conditioned medium sel Leydig untuk memperoleh sel Leydig (Gambar 1). Sebagai data tambahan juga dilakukan analisis terhadap kandungan testosteron dan kandungan protein yang terdapat di dalam conditioned medium sel Leydig.
Testis tikus
Gambar 1. Alur kegiatan penelitian
Tahap ketiga Tahap kedua Tahap pertama Sel Leydig Pasase Medium Kultur Optimum Koleksi conditioned medium (CM)
Population Doubling Time (PDT) Kemurnian, konsentrasi dan viabilitas galur sel
ELISA, SDS PAGE, Spektrofotometer
Profil hormon testosteron dan protein CM
Koleksi stem cell mesenkimal sumsum
tulang Isolasi tibia atau femur
tikus dewasa Kultur in vitro: 1.DMEM+NBCS10% 2.DMEM+testosteron 10 ng/ml 3.DMEM+CML 50% 4.DMEM+CML 50%+hCG 2,5 IU/ml Kultur in vitro dengan perlakuan:
1. DMEM+ NBCS 10%
2. DMEM + NBCS 10%+hCG 2,5 IU/ml
3. DMEM + NBCS 10%+ITS
4. DMEM + NBCS 10%+hCG +ITS
CML1, CML2, CML3, CML4
Isolasi dan purifikasi: Nycodenz I, II dan Percoll Kemurnian,
konsentrasi dan viabilitas sel Leydig
Viabilitas setelah kultur (3 hari)
CML 4 (hCG+ITS)
Deteksi Sel Leydig ??
Pewarnaan γ -HSD Morfologi
Uji testosteron (ELISA) Uji protein (spektrofotometer)
KONSENTRASI, KEMURNIAN DAN VIABILITAS SEL
LEYDIG HASIL PURIFIKASI DENGAN GRADIEN
NYCODENZ DAN KULTUR IN VITRO
ABSTRAK
Peran sel Leydig sebagai penghasil hormon testosteron di dalam tubuh jantan diketahui diperlukan untuk terjadinya proses spermatogenesis. Pada kasus hipogonadism, terapi transplantasi sel Leydig telah dilakukan. Dengan demikian penelitian kultur in vitro sel Leydig diperlukan untuk mendukung ketersediaan sumber sel Leydig yang akan ditransplantasi.
Koleksi sel dari jaringan testis menghasilkan suspensi dengan jenis sel yang beragam. Untuk mendapatkan sel Leydig diperlukan proses purifikasi dan yang umum digunakan adalah gradien Percoll, namun dilaporkan bahwa Percoll dapat dimetabolisme oleh sel Leydig sehingga menyebabkan toksisitas rendah pada sel yang dapat mempengaruhi viabilitas dan perolehan jumlah sel hidup setelah dikultur. Untuk mengatasi permasalahan tersebut, telah dilakukan purifikasi dengan menggunakan gradien Nycodenz yang tidak toksik terhadap sel. Perlakuan dilakukan dengan gradien Nycodenz I, 3 kolom (5%, 10%, 15%) dan II, 5 kolom (4%,8%,10%,12%,15%) yang dibandingkan dengan gradien Percoll 5 kolom (21%, 26%, 34%, 40% dan 60%). Parameter yang diamati adalah konsentrasi, kemurnian, viabilitas serta jumlah sel Leydig hidup setelah purifikasi dan kultur in vitro. Hasil menunjukkan bahwa isolasi dan purifikasi sel Leydig dengan gradien Nycodenz I (85,53%) dan II (91,40%) menghasilkan kemurnian yang tidak berbeda dibandingkan dengan gradien Percoll (92,22%). Viabilitas sel Leydig pada Nycodenz I (85,53%) dan Nycodenz II (91,40%) juga tidak berbeda dibandingkan dengan Percoll (92,22%). Konsentrasi sel yang diperoleh setelah dipurifikasi menggunakan gradien Nycodenz I (7,12x106sel/ml) dan gradien Nycodenz II (7,03 x 106sel/ml ) masih rendah (p<0,05) dibandingkan dengan Percoll (15,42x 106sel/ml). Peranan Nycodenz II (3,88x106 sel/ml) terhadap konsentrasi sel terlihat tinggi setelah 3 hari dikultur dibandingkan Nycodenz I (3,21 x 106sel/ml) dan Percoll (2,44 x106sel/ml) (p<0,05). Viabilitas sel setelah dikultur juga tampak lebih baik pada Nycodenz I (90%) dan Nycodenz II (91,16%) dibandingkan dengan Percoll (82,30%). Disimpulkan bahwa Nycodenz II lebih efektif mempurifikasi sel Leydig dan setelah dikultur, penggunaan gradien Nycodenz lebih baik terhadap konsentrasi dan viabilitas sel Leydig dibandingkan dengan Percoll.
ABSTRACT
The role of Leydig cells is to produce testosterone which is important for spermatogenesis process. The transplantation of Leydig cells has been success to increase testosterone concentration in hypogonadism. Research on in vitro culture of Leydig cell is required to support availability of Leydig cell for transplantation. The purification of Leydig cell from testicular tissue produce heterogenous of cells. It is therefore further method to purify of Leydig cells is required. Percoll gradient is one method to purify Leydig cells, but it is reported that it can cause toxicity to Leydig cells, so it can influence on cell viability and recovery rate. To overcome these problem, this research used non toxic Nycodenz gradient with different column namely (I) 3 columns (5%, 10%, 15%) and (II) 5 columns (4 % ,8 % ,10 % ,12 % ,15 % ) compared with 5 columns Percoll gradient (21 %, 26 %, 34 %, 40 % and 60 % ) as control. The percentage of cell viability, live cells and the cell concentration were measured after purification and culture. The result showed that the purity of Leydig cells after purification using Nycodenz I (85.53%), Nycodenz II (91.40%) were comparable with Percoll (92.22%). However, the cells concentration after purification with Nycodenz (I: 7.12 x 106 cells/ml; II : 7.03 x x 106 cells/ml) showed still lower than Percoll (15.42 x 106 cells/ml) (p<0.05). After 3 days culture, the cells concentration was higher in Nycodenz I (3.21 x 106cells/ml) , Nycodenz II (3.88 x 106cells/ml) than Percoll gradient (2.44 x 106cells/ml), with similar result on cell viability. It can be concluded that Nycodenz gradient II more effective to purify Leydig cells to obtain high concentration and viability of cells after culture.
Keywords : Leydig cells, gradient, Nycodenz, Percoll, purity, viability
PENDAHULUAN
Hormon testosteron dihasilkan oleh sel Leydig dan berperan penting dalam proses spermatogenesis yaitu perkembangan sel spermatogonia menjadi spermatozoa. Jika terjadi kekurangan hormon testosteron, dapat menghambat proses spermatogenesis dalam tubulus seminiferus. Pada saat ini, kondisi defisiensi testosteron umumnya diatasi dengan cara pemberian suplemen hormon testosteron sintetis. Namun pada manusia terapi dengan cara ini dapat menyebabkan resiko jangka panjang. Oleh karena itu, beberapa peneliti telah melakukan upaya terapi alternatif dengan menggunakan transplantasi sel Leydig sebagai penghasil hormon testosteron. Penggunaan sel Leydig sebagai terapi
alternatif penghasil hormon testosteron membutuhkan sumber sel Leydig dalam konsentrasi dan viabilitas yang memadai. Untuk itu diperlukan penelitian menghasilkan sel Leydig dengan konsentrasi, kemurnian dan viabilitas tinggi, baik setelah purifikasi maupun setelah dikultur secara in vitro.
Isolasi dan purifikasi sel Leydig telah banyak dilakukan dengan beberapa metode, di antaranya gradien Percoll dengan konsentrasi yang bervariasi. Percoll adalah silika koloid yang dilapisi oleh polyvinylpyrrolidone (PVP) merupakan bahan yang dapat digunakan untuk memisahkan berbagai jenis sel. Hasil purifikasi Chemes et al. (1992) menggunakan gradien Percoll diskontinu pada gradien 34% dan 60% menghasilkan sel Leydig dengan kemurnian 90%, sedangkan Bilinska et al. (2009) menggunakan metoda yang sama memperoleh kemurnian sebesar 80-83% hasil peneguhan dengan pewarnaan 3β-hydroxysteroid dehidrogenase (3β-HSD).
Wakefield et al. (1982) melaporkan bahwa penggunaan gradien Percoll untuk mengisolasi sel Leydig tikus pada suhu 20 C- 37 C dapat menyebabkan partikel Percoll masuk ke dalam sel Leydig yang berakibat menurunnya viabilitas sel. Hal tersebut disebabkan gradien Percoll bersifat sitotoksik. Gradien pemisah sel lainnya adalah Nycodenz atau Iohexol, yang mempunyai beberapa kelebihan dibandingkan dengan Percoll di antaranya mempunyai osmolalitas dan viskositas rendah tetapi mempunyai densitas yang tinggi, sehingga dapat secara efektif memisahkan makromolekul dan sel dengan rentang ukuran yang lebih luas untuk jenis sel yang lebih bervariasi. Nycodenz bersifat stabil, larut dalam air dan dapat disterilisasi dengan filter syringe sehingga mudah digunakan di laboratorium, bersifat non sitotoksik terhadap sel mammalia. Selain itu, Nycodenz dengan mudah dapat dihilangkan dari suspensi sel dengan cara sentrifugasi dibandingkan dengan gradien dari bahan lain karena residu gradien pemisah dapat menyebabkan kematian sel. Nycodenz dapat digunakan secara mudah dengan metode sederhana tanpa ada keterbatasan dalam suhu, pH dan stabilitas (Miller 2006). Gradien Nycodenz telah digunakan untuk memisahkan sel darah, sel hati, primordial germ cell (PGC), spermatogonia dan sel Sertoli (Evans & Flint 1985, Manayagi et al. 2003, Nakayama et al. 1999), namun penelitian menggunakan gradien Nycodenz untuk mengisolasi sel Leydig pada tikus belum dilaporkan. Untuk itu, penelitian ini dilakukan untuk menguji efektivitas gradien Nycodenz dalam meningkatkan konsentrasi, kemurnian dan viabilitas sel Leydig setelah diisolasi dan purifikasi serta kultur in vitro.
MATERI DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Embriologi, Bagian Anatomi, Histologi dan Embriologi, Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor mulai dari Desember 2011 sampai Mei 2012.
Materi Penelitian
Untuk mendapatkan suspensi testikular dilakukan isolasi dan koleksi dari testis yang dikoleksi dari tiga ekor tikus (Sprague Dawley) jantan dewasa berumur 8-10 minggu yang diperoleh dari Fakultas Peternakan IPB. Perlakuan terhadap hewan percobaan pada penelitian ini telah dilakukan dengan mengikuti kaidah ilmiah terstandar dengan memperhatikan prinsip-prinsip kesejahteraan hewan.
Metode Penelitian
Kegiatan penelitian yang dilakukan terdiri dari : 1. Pembuatan Suspensi Sel Testikuler 2. Isolasi dan Purifikasi Sel Leydig
3. Kultur In Vitro Sel Leydig Hasil Purifikasi
Pembuatan Suspensi Sel Testikuler
Tikus (Sprague Dawley) jantan dewasa berumur 8-10 minggu diambil testisnya setelah dibius dengan ether dan dikorbankan dengan cara cervical dislocation. Selaput tunika albuginea dan jaringan ikat lainnya dibuang, kemudian jaringan testis ditempatkan di dalam cawan petri berisi medium Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline (DPBS tanpa Ca dan Mg, Gibco 21600-010, Invitrogen NY, USA). Jaringan tersebut kemudian dicuci sebanyak tiga kali menggunakan medium DPBS yang ditambah serum (Newborn Calf Serum, NBCS, Gibco, 16010-159, Invitrogen, New Zealand) 0,1% (mDPBS). Pengambilan jaringan testis dilakukan secara aseptis kemudian dimasukkan ke dalam tabung yang berisi satu ml collagenase type I (Sigma, T9003, St Louis, MO, USA) 0,04% dan trypsin inhibitor (Sigma, T9003, St Louis, MO, USA) 10 µg/ml dalam DPBS dan diinkubasi di dalam waterbath (Eyela SB-24) pada suhu 34 C selama 40 menit. Suspensi sel diencerkan sebanyak empat kali volume awal dengan mDPBS, kemudian didiamkan selama dua menit agar sel mengendap. Cairan supernatan dikoleksi dan disentrifugasi (Kokusan H-26F) dengan kecepatan 200 g selama tiga menit. Pelet sel dicuci sebanyak dua kali menggunakan mDPBS dengan cara yang sama. Terakhir, pelet sel diencerkan dengan 500 µ l mDPBS.
Isolasi dan Purifikasi Sel Leydig
Isolasi dan purifikasi sel Leydig dilakukan dengan menggunakan metode gradien Nycodenz® (1002424, Axis-Shield PoC AS, Oslo Norway) yang dimodifikasi dari Nakayama et al. (1999). Suspensi sel kemudian dimasukkan ke dalam larutan Nycodenz dengan gradien 3 kolom 5%, 10% dan 15% (Nycodenz I) atau gradien 5 kolom 4%, 8%, 10%, 12%, 15% (Nycodenz II). Setelah itu, larutan gradien disentrifugasi menggunakan sentrifus swing rotor (Kokusan H-26F) dengan kecepatan 1.500 g selama 10 menit pada suhu ruang. Lapisan sel yang terbentuk kemudian dikoleksi dan dicuci berturut-turut dengan mDPBS sebanyak empat kali dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan 200 g selama tiga menit. Pelet sel diencerkan dengan 500 µl mDPBS.
Sebagai kontrol, isolasi dan purifikasi sel Leydig dilakukan dengan menggunakan gradien Percoll (Sigma P-1644St Louis, MO, USA) dengan 5 kolom yaitu 21%, 26%, 34% , 40% dan 60% (modifikasi Chemes et al. 1992). Setelah itu suspensi sel disentrifugasi berturut-turut dengan kecepatan 400 g selama 15 menit dan 800 g selama 15 menit dengan menggunakan sentrifus swing rotor pada suhu ruang, kemudian dilakukan perlakuan seperti pada Nycodenz.
Kultur In Vitro Sel Leydig Hasil Purifikasi
Sebanyak 1 x 106 sel/ml suspensi sel Leydig dari masing-masing perlakuan dikoleksi dan dikultur dalam medium DMEM (Sigma, D5532, St. Louis, MO, USA) yang ditambah NBCS 10% (mDMEM) di dalam inkubator CO2 5% dengan suhu 37o C selama tiga hari.
Evaluasi
Evaluasi dilakukan pada saat setelah purifikasi dan setelah dikultur. Parameter yang diamati adalah konsentrasi suspensi sel Leydig, kemurnian, viabilitas dan sel Leydig hidup. Penghitungan konsentrasi suspensi sel Leydig dilakukan dengan menggunakan hemositometer (kamar hitung) Neubauer sedangkan penentuan kemurnian sel Leydig dilakukan dengan pewarnaan histokimia 3β-HSD (Lampiran 1). Pewarnaan ini merupakan pewarnaan spesifik terhadap sel Leydig. Proses pewarnaan dapat mendeteksi enzim 3β-HSD yang terdapat di dalam sel Leydig dan menyebabkan sel berwarna ungu. Pengujian viabilitas sel dilakukan dengan pewarnaan Trypan Blue (SIGMA T6146- St. Louis, MO, USA). Sel yang mati akan berwarna biru karena mengalami kerusakan membran sehingga zat pewarna dapat masuk ke dalam sel. Penghitungan persentase sel Leydig hidup dilakukan untuk mengetahui jumlah sel Leydig sebenarnya yang terdapat di dalam suspensi sel.
Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Purifikasi sel Leydig hasil isolasi dari tubulus seminiferus dilakukan dengan dua perlakuan yaitu gradien Nycodenz 3 kolom (5%, 10% dan 15% disebut Nycodenz I), gradien Nycodenz 5 kolom (4%,8%,10%,12%, dan 15% disebut Nycodenz II) dan gradien Percoll 5 kolom (21%, 26%, 34%, 40% dan 60%) sebagai kontrol. Parameter yang diamati adalah konsentrasi sel, kemurnian, viabilitas, dan sel Leydig hidup setelah purifikasi dan kultur in vitro. Setiap perlakuan dilakukan tiga kali ulangan. Data yang diperoleh kemudian diuji secara