1.Perlu dilakukan identifikasi jamur endofit AFKR – 5.
2.Perlu dilakukan analisis lebih lanjut untuk mengetahui struktur dari produk biotransformasi dengan menggunakan UV, IR, dan NMR.
3.Perlu dilakukan uji aktivitas farmakologi terhadap produk biotransformasi yang dihasilkan serta membandingkannya dengan senyawa asal untuk mengetahui apakah aktivitas produk biotransformasi lebih baik dari senyawa asal.
40
DAFTAR PUSTAKA
Agusta A, Maehara S, Ohashi K, Simanjutak P and Shibuya H. 2005. Stereoselective Oxidation at C-4 Flavans by the Endophytic Fungus
Diaporthe sp. Isolated from a Tea Plant. Chem. Pharm. Bull. 53: 1565 –
1569.
Agusta A, Ohashi K, and Shibuya H. 2006. Bisanthraquinone Metabolites Produced by Endophytic Fungus Diaporthe sp. Chem Pharm Bull. 54 : 579-582.
Agusta, A. 2007. Biotransformasi (-)-Epigalokatekin-3-O-galat Menjadi (-)-2R,3S-Dihidromirisetin oleh Fungi Endofit Diaporthe sp. Isolat E dari Tumbuhan Teh. Hayati Journal Of Biosciences, p150-154.
Agusta, A. 2009. Biologi dan Kimia Jamur Endofit. Bandung: ITB Press.
Agusta, A. 2009. (2R,3S)-Dihidrokuersetin,Suatu Produk Biotransformasi (-)-Epikatekin Oleh Jamur Endofit Diaporthe sp.E. Berita Biologi, 9 (4).
Archangelisia flava. diakses 26 Mei 2010 dari www.plantamor.com
Bayman P, Ligia L, Raymond L.T., and D.J. Lodge. 1996. Variation in Endophytic Fungi from Roots and Leaves of Lepanthes ( Orchidaceae).
New Phytol. 135: 145 – 149.
Brady S.F., Singh M.P., Jeff E.J., and Clardy J. 2000. Cytoskyrins A and B, New BIA Active Bisanthraquinones Isolated from an Endophytic Fungus.
Organic Letters, Vol.2, No.25, 4047 – 4049.
Brady S.F., Wagenaar M.M., Singh M.P., Janso J.E., and Clardy J. 2000. The Cytosporones, New Octaketide Antibiotics Isolated from an Endophytic Fungus. Organic Letters, Vol.2, No.25, 4043 – 4046.
Borge K.B. 2007. Endophytic fungi as models for the Stereoselective Biotransformation of Thioridazine. Appl Microbiol Biotechnol 77:669–
674.
Dharmananda, Subhuti. 2005. New Uses Of Berberine. A Valuable Alkaloid from
Herbs for “Damp –Heat” Syndrome.
Fany Mahesa, Mitra. 2009. Biotransformasi Berberin Oleh Jamur Endofit Dari Tumbuhan Akar Kuning (Archangelisia flava (L). Merr). skripsi. FMIPA Universitas Andalas.
41
Freile M, Gianni F, Sortino M, Zamora M, Juarez A, Zacchino S, Enriz D. 2006. Antifungal Activity of Aqueous Extracts and of Berberine Isolated from Berberis heterophyll. Acta Farm. Bonaerense 25 (1): 83-8.
Furuya T, Nakano M, Yoshikawa T. 1978. Biotransformation of (RS)-Reticuline And Morphinan Alkaloids By Cell Cultures of Papaver somniferum.
Phytochemistry. Vol 17, pp 891 – 893.
Grycova’ L, Dosta J., Marek R. 2007. Quatenary Protoberberine Alkaloids. Phytochemistry 68,150-175.
Issat T, Jakobislak M, Golab J. 2006. Berberine, A Natural Cholesterol Reducing Product, Exerts Antitumor Cytostatic,Cytotoxic Effects Independently From The Mevalonate Pathway. Oncology Reports 16: 1273 – 1276. Jamal Y, Ilyas M, Kanti A, Agusta A. 2009. Keragaman Jenis Jamur Endofit pada
Pandan Wangi (Pandanus amarylifolius) dan Aktivitas Antijamur Metabolit yang Diproduksinya. Biota Vol. 14 (2): 81 – 86.
Klemke C, Kehraus S, Wright A.D., and Konig G.M. 2004. New Secondary Metabolit from the Marine Endophytic Fungus Apiospora montagnei. J.Nat. Prod.,67,1058-1063.
Kunii T, Kagei K, Kawakami Y, Nagai Y, Nezu Y, and Sato T. 1985. Indonesian Medicinal Plants: Furanoditerpens from Arcangelisa flava. Chem Pharm Bull 33 (2) 479 – 487.
Lumyong Salsamon, Pipob Lumyong, Eric H.C., McKenzie, and Kevin D. 2002. Enzymatic Activity Of Endophytic Fungi Of Six Native Seedlings Species From Doi Suthep-Pui National Park, Thailand. Canadian Journal Of Microbiology; 48,12.
Ma Y, Zhu H., Su Y, Shi Q, and Li Y. 2007. Isolation and Identification of Endophytic Fungi from Eucommia ulmoides. International Symposium on Eucommia ulmoides,Vol.1, No.1, 82 – 85.
Meji’a L.C, Rojas E.I, Maynard Z, Bael SV, Arnold A.E, Hebbar P, Samuels GJ, Robbins N, Herre EA. 2008. Endophytic Fungi as Biocontrol Agents of Theobroma cacao Pathogens. Biological Control 46 : 4 – 14.
Phillipine Medicinal Plants. Archangelisia flava. diakses 26 Mei 2010 dari www.stuartxchange.org/Abutra.html
Verpoorte R, Siwon J, Essen GFA, Tieken M, Svendsen AB. 1982. Studies On Indonesian Medicinal Plants. VII. Alkaloids of Arcangelisia flava.
42
Sa’roni, Adjirni, Winarno W. 1995. Efek Antidiare Infus Batang Kayu Kuning Archangelisia flava L. pada Tikus Putih dan Toksisitas Akut. Pusat Penelitian dan Pengembangan DepKes RI. Jakarta.
Shibuya H, Kitamura C, Maehara S, Nagahata M, Winarno H, Simanjutak P, Kim H.S, Wataya Y, Ohashi K. 2003. Transformation of Cinchona Alkaloids into 1-N-Oxide Derivatives by Endophytic Xylaria sp. Isolated from
Cinchona pubescens. Chem Pharm Bull. 51(1) 71 – 74.
Singh A, Duggal S, Kaur N, Singh J. 2010. Berberine: Alkaloid with wide spectrum of pharmacological activities. Journal of Natural Products, Vol. 3:64-75.
Subeki, Matsuura H, Takahashi K, Yamasaki M, Yamato O, Maede Y, Katakura K, Suzuki M, Trimurningsih, Chairul, Yoshihara T. 2005. Antibabesial Activity of Protoberberine Alkaloids and 20 Hydroxyedysone form
Arcangelisia flava against Babesia gibsoni in Culture. J. Vet. Med.Sci. 67 (2): 223 – 227.
Unesco.1998. Plant Resources of South East Asia. No.12(2).
Zhang HW, Song YC, and Tan RX. 2006. Biology and Chemistry Of Endophytes.
43
Lampiran 1. Komposisi medium yang digunakan
No. Nama Medium Komposisi Jumlah
1. GYP (glucose yeast-extract peptone) Pepton 5 gr
yeast extract 1 gr Glukosa 20 gr KH2PO4 0,5 gr MgSO4.7H2O 0,5 gr FeSO4.7H2O 10 mg CaCO3 0,2 gr air sumur 1 l
2. PDB (potato dextrose broth) potaoes infusion 200 gr
dekstrosa 20 gr
air sumur 1 l
3. PDA (potato dextrose agar) Agar 15 gr
dekstrosa 20 gr
potatoes infusion 4 gr
44
Lampiran 2. Skema Kerja
2.1 Skrining Biotransformasi Berberin
dikulturkan pada 100 ml medium GYP dan PDB steril
diinkubasi pada shaker pada suhu 27 0C dan kecepatan 120 rpm
Penambahan substrat berberin:
o + 10 ml larutan berberin ( 1mg dalam 1 ml metanol) o kultivasi dilanjutkan dengan diinkubasi pada shaker
dengan suhu 27 0C dan kecepatan 120 rpm
Pengambilan sampling dilakukan setelah 1,2,3,7,14 hari penambahan berberin.
-Ambil 5 ml kultur jamur endofit
-+ diklorometan : metanol (5:1) sebanyak ± 5 mL -dikocok dengan vortex
-ambil lapisan bawah
-dikeringkan dengan rotary evaporator
-KLT (fase diam silica gel dan fase gerak
diklorometan : metanol= 6:1 (7 ml) ditambah asam asetat glasial 1 tetes )
-diamati di bawah sinar UV 254 nm dan 366 nm -disemprot dengan dragendroff
Empat isolat jamur endofit yang diisolasi dari akar kuning (AFKR-2, 3, 5, dan 13)
Kultur Jamur AFKR-2,3,5,13
Kultur jamur endofit berumur 4 hari
Monitoring hasil biotransformasi
Ekstrak pekat
Noda pada plat
(Setelah 14 hari penambahan berberin noda pada plat
menunjukkan AFKR-5 mampu menghasilkan produk
45
2.2 Scalling up Proses Biotransformasi Berberin Oleh Jamur AFKR-5
dikulturkan pada 5x200 ml medium GYP
diinkubasi pada shaker selama 4 hari pada suhu 27 0C dan kecepatan 120 rpm
- masing – masing + 5 x 20 ml larutan berberin steril (1mg/1ml) - Lanjutkan kultivasi diinkubasi pada shaker dengan suhu 27 0C dan
kecepatan 120 rpm
- 5 ml sampel + diklorometan : metanol (5:1) sebanyak ± 5 mL - Kocok dengan vortex, ambil lapisan bawah, keringkan dengan rotary
evaporator
- Ekstrak dianalisis KLT, diamati disinar UV 254 nm dan 366 nm. Ekstrak dianalisis juga dengan HPLC. Lanjutkan kultivasi.
Diekstrak dengan diklorometan-metanol (5:1)
kondisi HPLC = Capcell Pak C-18 (Shiseido 4,6 mm x 250 mm), fase diam air millipore : asetonitril = 90 %: 10%, laju alir : 1 ml/menit, lama aliran 30 menit, detektor UV λ 266 nm.
Fraksinasi dengan kromatografi kolom Fasa diam : sephadex LH – 20
Fase gerak : metanol : aquadest = 90 % : 10 % Volume kolom : 275 ml
Purifikasi dengan KLT preparatif Fasa diam : silica gel F254
Fase gerak : diklorometan : metanol : amoniak 25 % = 5 : 3: 0,5 Kultur jamur AFKR – 5 pada medium GYP
Kultur jamur endofit setelah 14 penambahan berberin
Ekstrak diklorometan - metanol Ekstrak air
1
Kultur jamur AFKR-5 AFKR-5
Karakterisasi dengan MS 2 3
1 - A 1 - B
Kultur jamur endofit 10 hari setelah penambahan berberin
Partisi dengan n-heksana Analisis dengan KLT, HPLC
46
2.3 Ekstraksi Hasil Biotransformasi
-Jamur beserta biomassa dihancurkan dengan spatula
-Diekstrak dengan diklrometan:metanol=5:1 (6 ml),dikocok dengan stirer ±10 menit (dilakukan 3 kali).
Saring dengan kapas
Partisi dengan corong pisah, ambil lapisan bawah.
Pekatkan dengan rotary evaporator
Fase diam silica gel,fase gerak Kondisi HPLC: Capcell pak C-18 diklorometan: metanol = 6:1 (7 ml) (Shiseido 250 x 4,6 mm). ditambah asam asetat glasial 1 tetes. Fase gerak asetonitril: air =10:90. Diamati dibawah sinar UV 254 nm & 366 nm, Flowrate 1 ml/menit. Detektor serta disemprot dengan dragendroff. UV dengan λ 266 nm.
Kultur jamur AFKR-5 dalam medium GYP setelah 14 hari penambahan berberin
Ekstrak bercampur pelarut
Filtrat
Ekstrak diklorometan-metanol Ekstrak air
Ekstrak pekat
TLC HPLC
47
2.4 Partisi Ekstrak Hasil Biotransformasi
Larutkan ekstrak dengan metanol, kemudian partisi dengan n-heksana menggunakan corong pisah. Ambil lapisan atas.
Dikeringkan menggunakan rotary evaporator
hingga diperoleh ekstrak kental
2.5 Fraksinasi, Purifikasi, dan Karakterisasi Hasil Biotransformasi
Fraksinasi menggunakan kromatografi kolom. Fase diam Sephadex LH-20, fase gerak metanol 90%. (Volume kolom 275 ml)
Purifikasi menggunakan KLT preparatif
Fase diam silica gel, fase gerak diklorometan : metanol:amoniak 25 % = 3:3:0,5.
Ekstrak pekat diklorometan - metanol
Lapisan n-heksana Lapisan metanol
Ekstrak n-heksana Ekstrak metanol
Ekstrak metanol hasil partisi
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
F1 F2 F3
1-A 1-B
Karakterisasi dengan MS
48
Lampiran 3. Gambar jamur endofit AFKR–2 ,3 ,5, dan 13 yang digunakan untuk skrining proses biotransformasi
AFKR – 2 AFKR - 3
49
Lampiran 4. Hasil perbesaran spektrum produk biotransformasi menggunakan MS Water LCT Premier Xe Micromass Technology.
50
Lampiran 5. Hasil perbesaran spektrum produk biotransformasi menggunakan MS Water LCT Premier Xe Micromass Technology.