BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN
5.2 Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap fraksinasi dan pemurnian fraksi lain pada jamur endofit GKBt 2 yang memiliki aktivitas terhadap bakteri uji yang lebih tinggi.
Ahmad, Mahbob, Noor, Z.M., Ismail, N.H., Lajiz, N.H., Shaari, K., 2010. Evaluation of Antioxidant Potential of Medicinal Plants from Malaysian Rubiaceae ( subfamily Rubioideae). African Journal of Biotechnology. Vol 9, No.46, pp. 7948-7954.
Casez, 2004. Encyclopedia of Chromatography. USA : University of Toronto and Marcel Dekker.Inc
Choma, I., 2005. The Use of Thin-Layer Chromatography with Direct Bioautography for Antimicrobial Analysis. LCGC Europe, Vol 18, Issue 9, Desember 2005. Diakses pada 5 Januari 2013 pada http://www.chromatographyonline.com
Choma, I.M & Grzelak, E.M., 2010. Bioautographic detection in thin-layer chromatography. Journal Of Chromatography A. Poland : Elsevier. Day, R.A., A.L, Underwood. 2002. Analisis kimia Kuantitatif. Jakarta:
Erlangga.
Gandjar, I.G., Rohman, A., 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta : Pustaka Pelajar.
Gandjar, I., R., A., Samson, K. Van den Tweel-Vewmeulen, A.Oetari, I., Santoso. 1999. Pengenalan Kapang Tropik Umum. Jakarta : Yayasan Obor Indonesia.
Gandjar, I., W. Sjamsudrizal, dan A. Oetari. 2006. Mikologi :Dasar dan Terapan. Jakarta : Yayasan Obor Indonesia.
Hoan tjay, T., Rahardja, K., 2002. Obat-obat penting : khasiat, penggunaan dan efek sampingnya.5th ed. Jakarta : PT Elex Media Komutindo.
Ismail, NH., Alias, A., Osman, C.P. 2012. Alkaloids and Antraquinones from Malaysian Flora, Phytochemicals - A Global Perspective of Their Role in Nutrition and Health, Diakses di
www.intechopen.com pada 20 Februari 2013.
Jamal, Y., Praptiwi, Fathoni, A., Agusta, A., 2011. Bioproduksi Flouroglusinol oleh Endofit Coelomicetes AFAS-AF3 yang
Diisolasi dari Tumbuhan Archangelesia flava L.Merr. Berkas Penelitian Hayati Vol. 16, hal 169-172.
Kusumaningtyas, E., Astuti, E., Darmono. 2008. Sensitivitas Metode Bioautografi Kontak dan Agar Overlay dalam penentuan senyawa anti kapang. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. Vol.6, No.2, hal 75 – 79.
Labeda, D., P., 1990. Isolation biotechnologic Organisme From Nature. New York : McGraw- Hill Publishing Company.
Lestari. I., D., 2008. “Kajian Awal Potensi Tumbuhan Indigeous dan Keragaman Funginya untuk Revegetasi Lahan Bekas Tambang Timah di Pulau Bangka”. Program Pasca Sarjana. Institut Pertanian Bogor.
Liang, H., Xing, Y., Chen, J., Zhang, D., Guo, S., Wang, C. et al., 2012. Antimicrobial activities of endophytic fungi isolated from Ophiopogon japonicus (Liliaceae). BMC Complementary and Alternative Medicine. Beijing.
Mardiastuti, Kurniawan, A., Kiranasari, A., Ikaningsih, Kadarsih, R., 2007. Emerging Resistance Pathogen: Situasi Terkini di Asia, Eropa, Amerika Serikat, Timur Tengah dan Indonesia. Majalah Kedokteran Indonesia, Vol.57, No.3.
Mycek, Mary, J., Harvey, R.A., Champe, P.,C., 2001. Farmakologi : Ulasan Bergambar Edisi 2. Jakarta : Penerbit Widya Medika. Nithya, K. & Muthumary, J., 2011. Bioactive Metabolite Produced By
Phomopsis Sp, an Endophytic fungus in Allamanda cathartica Linn. Recent Research in Science and Technology. Vol.3, No.3, p 44-48.
Osman, C.P., Ismail, N.H., Ahmad, R., Ahmat, N., Awang, K., Jaafar, F.M., 2010. Anthraquinones with Antiplasmodial Activity from the Roots of Rennellia elliptica Korth. (Rubiaceae). Molecules. Vol. 15, hal : 7218-7226;
Parija, C.,S., 2009. Textbook of Microbiology & Immunology. India : El sevier.
Pelczar, M.,J., & E.,C.,S., Chan .1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid I. Penterjemah: R.S. Hadioetomo et al. Jakarta: UI Press.
Pratiwi, S.,T., 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga.
Prescott, L.M., JP, Harley, D.A. Klein. 2005. Microbiology, 6th Ed. New York : McGraw-Hill Co Inc.
Sarker, D.S., Latif Zahid, Gray, I.A. 2006. Natural Product Isolation, 2nd edition. New Jersey : Humana Press Inc.
Schwalbe, R., Steele-Moore, L., Goodwin, A.,C., 2007. Antimicrobial Susceptibility testing Protocols. USA : CRC Press.
Setiabudy, R., 2007. Farmakologi Dan Terapi. Ed5. Departemen Farmakologi dan Terapeutik FKUI, Jakarta : Balai Penerbit FKUI. Species 2000 & ITIS Catalogue of Life. 2010. Indexing The World’s Known Species. Diakses tanggal 5 januari 2013, di http://www.catalogueoflife.org/annualchecklist/2010/details/specie s/id/4088607
Strobel, G.A., Daisy, B., 2003. Bioprospecting for Microbial Endophytes and Their Natural Products. Vol. 67, No. 4 p. 491–502. American Society for Microbiology.
Suratman. 2008. The Indonesian Species of Rennellia Korth. (Rubiaceae). Jurnal Biodiversitas. Vol 9, No. 4, hal 259 – 263.
Talaro, K.,P., 2005. Foundation in Microbiology, 5th ed. New York : Mc Graw Hill Higher Education.
Valgas, C., de Souza, S.M., Smania, E.F., Smania, A. 2007. Screening Methode To Determine Antibacterial Activity Of Natural Product. Brazilian Journal of Microbiology. Vol 34, p 369-380.
Vashista, B.,R., 1992. Botany for Degree Student: Fungi. S.Chand and Company.
Zhao, J., Mou, Y., Shan, T., Li, Y., Zhou, L., Wang, M., Wang, J., 2010. Antimicrobial Metabolites from the Endophytic Fungus Pichia guilliermondii Isolated from Paris polyphylla var. Yunnanensis. Jurnal molekul, Vol 15.
Zhao, J., Zhou, L., Wang, T., Shan, T., Zhong, L., Liu1, X., dan Gao, X., 2010. Endophytic fungi for producing bioactive compounds originally from their host plants. Current research, Technology and education Topics in applied Microbiology and Microbial Biotechnology.
Zuhud, E. A.,M., 2009. Potensi Hutan Tropika Indonesia sebagai Penyangga Bahan Obat Alam untuk Kesehatan Bangsa. Jurnal Bahan Alam Indonesia. Vol. 6, No.6, hal : 227-232.
Lampiran 1. Alur Penelitian
Ekstraksi hasil scalling Up Jamur endofit
Jamur diiidentifikasi secara morfologi Scalling Up kultivasi Jamur
dengan aktivitas antibakteri paling besar
Skrining aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi
Skrining produksi metabolit sekunder ekstrak Ekstraksi hasil kultur jamur endofit
Masing-masing 23 isolat jamur endofit yang diisolasi dari akar, batang, daun dan biji Tumbuhan Ginseng Kuning (Rennellia
elliptica Korth)
Kultivasi pada medium PDB
Isolasi metabolit sekunder
F1
F2 F3
F4
F5
Fn
Fraksi murni dan aktif
Lampiran 2. Bagan Kerja Uji aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi
Pelat KLT Ditotolkan 10 μL pada pelat KLT ukuran 8 x 8
cm
Kons. Ekstrak 10 mg/mL dalam aseton 23 ekstrak etil asetat jamur endofit dari Ginseng Kuning Dicelupkan pada cawan petri steril yang berisi suspensi bakteri uji
Terbentuk zona bening pada latar pelat KLT berwarna
merah
(Aktivitas antibakteri (+) ) Diletakkan pada cawan petri yang telah
diletakkan kapas steril basah
Inkubasi selama 20 jam pada suhu 37 0C
Lampiran 3. Bagan Kerja Scaling Up dan Ekstraksi Hasil Scaling Up
Ekstraksi dengan etil asetat 3x
Dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator
Dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator
Evaporasi ekstrak dengan vacum rotary evaporator
Ekstrak pekat Ekstak Heksana
Ekstrak pekat Ekstak Metanol
Dilarutkan dengan 100 mL metanol partisi dengan 100 mL heksana 3 x Ekstrak pekat
Ekstrak EtOAc Fraksi air Dipekatkan dengan
vacum rotary evaporator
Ekstrak pekat Media Ekstraksi dg etil
asetat 3 x
Ekstrak Ekstrak
Maserasi dengan aseton 3 x Biomassa
Diinkubasi 3 minggu pada suhu kamar dengan kondisi statis
500 mL x 4 erlemeyer ukuran 2 L 200 mL x 15 erlenmeyer ukuran 500 mL Diinokulasi pada media PDB didalam erlenmeyer Isolat GKBt 2 pada media PDA miring
Diinokulasi pada media PDA miring sebagai Stock Culture
Lampiran 4. Bagan Kerja Fraksinasi
F.5.8.b
5 mg F.5.8.a
4,5 mg Purifikasi menggunakan KLT preparatif dengan eluen Kloroform : Metanol 7:1
F.5.10 10,5 mg F.5.9 7,3 mg F.5.8 9,8 mg F.5.7 0,3 mg F.5.6 3,5 mg F.5.5 4,7 mg F.5.4 2,9 mg F.5.3 1,7 mg F.5..2 3,2 mg F.5.1 3,4 mg
Fraksinasi menggunakan kromatografi kolom dengan fase diam silica 70 – 230 mesh, menggunakan fase gerak kloroform : Metanol (10:1, 5:1, 0:1)
F.8 4,1 mg F.14 0,6 mg F.15 15,2 mg F.13 1,2 mg F.12 1,8 mg F.11 22,2 mg F.10 2,2 mg F.9 1,5 mg F.7 21 mg F.6 9,7 mg F.5 47 mg F.4 40,2 mg F.3 58,9 mg F.2 387 mg F.1 205 mg
Fraksinasi menggunakan kromatografi kolom dengan fase diam Sephadex LH 20, menggunakan fase gerak Alkohol 96 %
Lampiran 5. Perhitungan Koloni Bakteri 1. Koloni bakteri S.aureus
Jumlah koloni suspensi
Jumlah koloni suspensi = 105x106 / 10-1 =1,05 x 109 Diencerkan menjadi koloni 105 CFU/mL :
2. Koloni Bakteri E.coli
Jumlah koloni suspensi
Jumlah koloni suspensi = 65x108 / 10-1 =6,5 x 1010 Diencerkan menjadi koloni 105 CFU/mL :
Lampiran 6. Skema Pengenceran Larutan Uji
Kemudian, ditambahkan inokulum bakteri uji kedalam larutan uji masing-masing sumuran 100 µL :
Lampiran 7. Hasil Uji MIC
(a) (b) (c) (d)
(e) (f) (g) (h) a. Fraksi F.5.8.a terhadap S. aureus e. Fraksi F.5.8.a terhadap E. coli
b. Fraksi F.5.8.b terhadap S. aureus f . Fraksi F.5.8.b terhadap E. coli c. Eritromisin terhadap S. aureus g. Kloramfenicol terhadap E.coli d. Kloramfenikol S. aureus h. Eritromisin terhadap E. coli SC = Sterility Control; GC = Growth Control ;SoC = Solvent Control.
Lampiran 8. Gambar hasil pewarnaan gram pada bakteri uji
(a) (b)
Gambar hasil pewarnaan gram pada pengamatan menggunakan mikroskop cahaya,
a. Hasil pewarnaan gram pada bakteri gram positif / S.aureus (perbesaran 40x10)
b. Hasil pewarnaan gram pada bakteri gram negatif / E.coli (perbesaran 40x10x10)
Lampiran 9. Komposisi Media
1. Media Potato Dextrose Agar / PDA (DifcoTM)
Bahan Jumlah Agar-agar 15 g Seduhan kentang 4 g Dekstrosa 20 g Air 1 L pH akhir 5,61± 0,2, suhu 250 C Cara Pembuatan :
39 gram PDA disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit.
2. Media Potato Dextrose Broth /PDB (DifcoTM)
Bahan Jumlah Pati kentang 4 g Dekstrosa 20 g Air 1 L pH akhir 5,1± 0,2, suhu 250 C Cara Pembuatan :
24 gram PDB disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit
3. Media Mueller Hinton Broth / MHB (Criterion)
Bahan Jumlah
Asam kasein hidrolisis 17,5 g
Ekstrak sapi 2 g
Pati 1 ,5 g
Air 1 L
pH akhir 7,4 ± 0,2, suhu 25 0C
Cara pembuatan:
21 gram MHB disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit.
4. Media Nutrient Agar /NA (DifcoTM)
Bahan Jumlah
Agar 15 g
Gelatin pepton 5 g
Ekstrak daging sapi 3 g
Air 1 L
pH akhir 7,4 ± 0,2 suhu 25 0C
Cara pembuatan:
23 gram NA disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit.
5. Media Mueller Hinton Agar /MHA (CriterionTM)
Bahan Jumlah
Asam Kasein Hidrolisat 17,5 g
Ekstrak Daging Sapi 2 g
Pati 1,5 g
Agar 17 g
Air 1 L
pH akhir 7,4 ± 0,2 suhu 25 0C
Cara pembuatan:
38 gram MHA disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit
6. Media Brain Heart Infussion/BHI ( BBLTM)
Bahan Jumlah
Brain Heart, Infusion from (solids) 6 g Peptic Digest of Animal Tissue 6 g
Sodium Klorida 5 g
Dekstrosa 3 g
Pancreatic Digest of Gelatin 14,5g
Disodium fosfat 2,5
pH akhir 7,4 ± 0,2 suhu 25 0C
Cara pembuatan:
37 gram BHI disuspensikan dengan 1 liter aquadest, dipanaskan agar melarut sempurna dan disterilkan menggunakan autoklaf 121o C selama 15 menit.
Lampiran 10. Gambar Alat-Alat yang Digunakan
Rotary evaporator Incubator
Shaker incubator UV Cabinet Mikroskop
cahaya
Laminar air flow Autoklave
Oven