Analisis lebih mendalam untuk mengetahui berat molekul enzim keratinase murni Bacillus sp.BE-1 secara lebih akurat perlu dilakukan agar proses pemurnian dapat lebih disempurnakan. Analisis terhadap spesifitas dan stabilitas suhu enzim keratinase yang dihasilkan juga perlu dilakukan untuk aplikasi enzim di industri.
33 DAFTAR PUSTAKA
Allen, G. 1981. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Elsevier/North-Holland Biomedical Press, Amsterdam.
Allpress, J.D., Mountain, G., dan P.C. Gowland. 2002. Production, purification, and characterization of an extracellular keratinase from Lysobacter NCIMB 9497. Letters in Applied Microbiology 34, 337-342.
Beurden, S. dan V. Hoff. 2005. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Biotechniques 38, 78-83.
Böckle, B., Galunsky, B., Muller, R., 1995. Characterization of a keratinolytic serine protease from Streptomyces pactum DSM 40530. Appl. Environ. Microbiol. 61(10), 3705-3710.
Bollag, D. M. dan Edelstein, S. J. 1991. Protein Methods. Wiley-Liss, Inc., New York.
Brandelli, A., Corrêa, A., dan Daroit, D.. 2010. Characterization of a keratinase produced by Bacillus sp. P7 isolatd from an Amazonian environment. International Biodeterioration and Biodegradation 64, 1-6.
Bressollier P, Letourneau F, Urdaci M, dan B. Verneuil. 1999. Purification and characterization of a keratinolytic serine proteinase from Streptomyces
albidoflavus. Appl. Environ. Microbiol. 65(6), 2570-2576.
Cai, C., Chen, J., Qi, J., Yin, Y., Zheng, X. 2008. Purification and characterization of keratinase from a new Bacillus subtilis strain. Journal of Zhejiang University SCIENCE B 9, 713-720.
34 Gradišar, H., Friedrich, J., Krizaj, I., dan R. Jerala. 2005. Similarities and specificities of fungal keratinolytic proteases: comparison of keratinases of
Paecilomyces marquandii and Doratomyces microspores to some known
proteases. Applied and Environmental Microbiology 71, 3420-3426.
Gupta, R dan P. Ramnani. 2006. Microbial keratinases and their prospective applications: an overview. Appl. Microbiol. Biotechnol. 70, 21-33.
Huang, Q., Peng, Y., Li, X., Wang, H., dan Y. Zhang. 2002. Purification and characterization of an extracellular alkaline serine protease with dehairing function from Bacillus pumilus. Current Microbiology 46, 169-173.
Ignatova, Z., Gousterova, A., Spassov, G., dan P. Nedkov. 1999. Isolation and partial characterization of extracellular keratinase from a wool degrading thermophilic actinomycete strain Thermoactinomyces candidus. Canadian Journal of Microbiology 45, 217-222.
Kumar, C.G. 2002. Purification and characterization of a thermostable alkaline protease from alkalophilic Bacillus pumilus. Letters in Applied Microbiology 34, 13-17.
Lin X., Lee C. G., Casale E. S., dan J. C. H. Shih. 1992. Purification and characterization of a keratinase from a B. licheniformis strain. Appl. Environ. Microbiol. 58, 3271-3275.
Macedo, et al. 2005. Novel keratinase from Bacillus subtilis S14 exhibiting remarkable dehairing capabilities. Appl. Environ. Microbiol. 1, 594-596.
Nam, G.W., Lee, D.W., Lee, H.S., Lee, N.J., Kim, B.C., Choe, E.A., Hwang, J.K., Suhartono, M.T., dan Y.R. Pyun. 2002. Native feather degradation by
Fervidobacterium islandicum AW-1, a newly isolated keratinase producing
35 Naz, S. 2002. Enzymes and Food. Oxford University Press, Oxford.
Nilegaonkar, S. S., Zambare, V. P., Kanekar, P. P., Dhakephalkar, P. K., dan S. S. Sarnaik. 2007. Production and partial characterization of dehairing protease from Bacillus cereus MCM B-326. Biores. Technol. 98, 1238-1245.
Onifade, A.A., Al-Sane, N.A., Al-Musallam, A.A., dan S. Al-Zarban. 1998. A Review: Potentials for biotechnological applications of keratin-degrading microorganisms and their enzymes for nutritional improvement of feathers and other keratin as livestock feed resources. Bioresource Technology 66, 1-11.
Page, D.S. 1989. Prinsip-prinsip Biokimia. R. Soendoro, penerjemah. Jakarta: Penerbit Erlangga. Terjemahan dari: Principles of Biological chemistry.
Pelczar, M.J. dan E.C.S. Chan. 2007. Dasar-dasar Mikrobiologi. Ratna Siri, penerjemah. UI-Press, Jakarta. Terjemahan dari: Elements of Microbiology.
Polgár, L. 1990. Mechanism of Protease Action. CRC Press, Florida.
Prescott, L.M., John P.H., dan A.K. Donald. 2002. Microbiology. McGraw-Hill Company, New York
Puspita, N. 2007. Studi Karakteristik Kitosanase dari Isolat Bacillus licheniformis MB-2. Skripsi. Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan. FATETA-IPB, Bogor.
Riffel, A., Lucas, F.S., Heeb, P., Brandelli. A., 2003. Characterization of a new keratinolytic bacterium that completely degrades native feather keratin. Arch. Microbiol. 179(4), 258-265.
Santos, R.M.D.B., Firmino, A.A.P., de Sá, C.M., dan C.R. Felix. 1996. Keratinolytic activity of Aspergillus fumigates Fresenius. Current
36 Microbiology 33, 364-370.
Scopes, R.K. 1981. Protein Purification. Principles and Practice. Di dalam: Bollag, D.M. dan S. J. Edelstein. Protein Methods. Wiley-Liss, Inc, New York. Hlm. 79.
Syed, D.G., Lee, J.C., Li, W., Kim, C. dan D. Agasar. 2008. Production, characterization and application of keratinase from Streptomyces
gulbargensis. Biores. Technol. 100, 1868-1871.
Tatineni, R, et al. 2007. Purification and characterization of an alkaline keratinase from Streptomyces sp. Bioresource Technology 99, 1596-1602.
Thys, R.C.S. dan A. Brandelli. 2006. Purification and properties of a keratinolytic metalloproteases from Microbacterium sp. J. Appl. Microbiol. 101, 1259-1268.
Walter H-E. 1984. Proteinases (protein as substrates). Method with haemoglobin, casein and azocoll as substrate. Di dalam: Bergmeyer J, Grassl M, editor.
Methods of Enzymatic Analysis. Edisi Ke-3. Verlag Chemie, Weinheim.
Hlm. 270-278.
Wang, S., Hsu, W., Liang, T., Yen, Y., dan Wang, C. 2008. Purification and characterization of three novel keratinolytic metalloproteases produced by
Chryseobacterium indologenes TKU014 in a shrimp shell powder medium.
Bioresource Technology 99, 5679-5686
Xie, F., Chao, Y., Yang, X., Yang. J., Xue, Z., Luo, Y., dan S. Qian. 2009. Purification and characterization of four keratinases produced by
Streptomyces sp. strain 16 in native human foot skin medium. Biores.
37 Yamamura, S., Morita, Y., Hasan, Q., Yokoyama, K., dan E. Tamiya. 2002. Keratin degradation: a cooperative action of two enzymes from
Stenotrophomonas sp.. Biochemical and Biophysical Research Communications 294, 1138-1143.
38 Lampiran 1. Komposisi media pertumbuhan dan media produksi
A. Media Luria Bertani Agar (LA) 1% tripton
1% NaCl
0,5% ekstrak khamir 2% agar
B. Media Luria Bertani Broth (LB) 1% tripton
1% NaCl
0,5% ekstrak khamir
C. Media Agar Substrat Bulu 0,05% K2HPO4
0,04% KH2PO4
0,05% NaCl
0,6% tepung bulu ayam 2% agar
pH 7,5
D. Media Produksi 0,03% K2HPO4 0,05% NaCl
1% tepung bulu ayam 0,05% NH4Cl
39 Lampiran 2. Komposisi larutan buffer
Buffer Tris-Cl 50 mM, pH 8 Larutan A:
Tris 6,057 gram
Air destilata 1 liter Larutan B:
HCl pekat
40 Lampiran 3. Kurva standar BSA untuk pengukuran kadar protein (modifikasi
Bollag dan Edelstein, 2010)
1. Komposisi pereaksi Bradford: Larutan Stok Bradford:
Coomassie Brilliant Blue G
Etanol 95% Asam fosfat 85% Larutan Kerja Bradford:
Larutan stok Bradford 30 ml
Asam fosfat 85% 30 ml
Etanol 95% 15 ml
Air destilata 425 ml
2. Kurva Standar BSA
Stok BSA (0,1 mg/ml): BSA 10 mg Air destilata 100 ml Dari stok tersebut, dilakukan pengenceran sebagai berikut:
Vol. Standar Vol. Air destilata Kons. Protein Abs. Abs. terkoreksi (µl) (µl) (µg/100µl) 20 980 0,2 0,3725 0,0010 40 960 0,4 0,3775 0,0060 60 940 0,6 0,3860 0,0145 80 920 0,8 0,3865 0,0150 100 900 1,0 0,3920 0,0205 200 800 2,0 0,4145 0,0340 400 600 4,0 0,4350 0,0545 600 400 6,0 0,4470 0,0665 800 200 8,0 0,4725 0,0920 1000 0 10,0 0,4985 0,1180
42 Lampiran 4. Metode prehidrolisis bulu ayam
A. Bahan
NaOH 1N 12,5 ml Bulu ayam 100,0 g
Air destilata 1 liter HCl pekat NaOH 1N B. Alat Erlenmeyer 2 liter Neraca analitik pH meter Heater Saringan Oven C. Metode
Campuran air destilata, bulu ayam, dan NaOH dididihkan dengan heater selama 15 menit. Campuran tersebut kemudian didiamkan hingga suhunya turun mendekati suhu ruang. Penyesuaian pH menggunakan HCl pekat atau NaOH 1N dilakukan agar campuran mencapai pH 7 (netral). Hasilnya kemudian disaring dan dikeringkan dengan oven sehingga diperoleh bulu ayam prehidrolisis untuk digunakan dalam berbagai analisis keratinase. Keratin dalam bulu ini telah lebih tersedia untuk dipecah oleh enzim karena telah diprehidrolisis oleh NaOH.
43 Lampiran 5. Metode pembuatan substrat bulu
A. Bahan
NaOH 1N 12,5 ml
Bulu ayam prehidrolisis 100,0 g
Air destilata 1 liter
HCl pekat NaOH 1N B. Alat Erlenmeyer 2 liter Neraca analitik pH meter Heater Saringan Oven C. Metode
Campuran air destilata, bulu ayam prehidrolisis, dan NaOH dididihkan dengan heater selama 15 menit. Campuran tersebut kemudian didiamkan hingga suhunya turun mendekati suhu ruang. Penyesuaian pH menggunakan HCl pekat atau NaOH 1N dilakukan agar campuran mencapai pH 7 (netral). Campuran inilah yang digunakan sebagai substrat bulu dalam analisis aktivitas keratinase metode modifikasi Walter (1984).
44 Lampiran 6. Metode analisis aktivitas keratinase (modifikasi Walter, 1984)
A. Bahan
1. Buffer Tris-Cl 50 mM, pH 8 2. Substrat bulu
3. Sampel enzim
4. Asam trikloroasetat (0,1 M)
5. Folin ciochalteau (1 bagian folin ciochalteau : 4 bagian air destilata) 6. Na2CO3 (0,4 M) B. Alat 1. Spektrofotometer 2. Tabung eppendorf 2 ml 3. Centrifuge 4. Water bath 5. Mikrotip 6. Mikropipet 7. Kuvet C. Prinsip
Substrat keratin peptida + asam amino
Pengukuran aktivitas berdasarkan laju pembentukan peptida dan asam amino. Asam amino yang terbentuk dipisahkan dengan penambahan TCA. Hal ini akan membuat asam amino larut sementara peptida dan asam amino akan mengendap. Hasilnya diwarnai dengan pereaksi folin agar dapat dibaca pada daerah sinar tampak dengan panjang gelombang 578 nm.
Asam amino tirosin dan triptofan yang larut akan bereaksi dengan folin membentuk warna biru. Penambahan Na2CO3 bertujuan untuk mendapatkan pH sekitar 11,5 yang merupakan pH optimum untuk intensitas dan stabilitas warna.
45 Lampiran 7. Kurva standar tirosin untuk pengukuran aktivitas keratinase
Stok tirosin (10 µM)
Sebanyak 0,0906 gram tirosin dilarutkan dengan menggunakan panas dalam 50 ml air destilata.
Larutan stok tirosin diencerkan dengan melarutkan 1 ml stok dalam 10 ml air destilata sehingga konsentrasi tirosin menjadi 1 µM.
Dari larutan tirosin 1 µM tersebut, dibuat campuran sebagai berikut.
Vol. standar Vol. air destilata Kons.tirosin Absorbansi Absorbansi (µl) (µl) (µM) terkoreksi 20 980 0,02 0,0085 0,0025 40 960 0,04 0,0100 0,0040 60 940 0,06 0,0135 0,0075 80 920 0,08 0,0175 0,0115 100 900 0,10 0,0205 0,0145 200 800 0,20 0,0145 0,0085 400 600 0,40 0,0165 0,0105 600 400 0,60 0,0200 0,0140 800 200 0,80 0,0225 0,0165 1000 0 1,00 0,0275 0,0215
47 Lampiran 8. Komposisi gel dan pereaksi untuk zymogram (Bollag dan Edelstein, 1991)
Bahan Separating gel (acrylamide 8%) Stacking gel (acrylamide 4%)
Larutan A 1350 µl 670 µl
Larutan B 1250 µl -
Larutan C - 1250 µl
Substrat gelatin 2400 µl -
Air bebas ion - 3000 µl
10% APS 50 µl 50 µl
TEMED 5 µl 5 µl
Pereaksi
Larutan A: (dalam 100 ml air destilasi) 30% (b/v) akrilamida 0,8% (b/v) bis-akrilamida Larutan B: (100 ml) 75 ml 2M Tris-Cl (pH 8,8)vvff 4 ml 10% SDS 21 ml H2O Larutan C: (100 ml) 50 ml 1M Tris-Cl (pH 6,8) 4 ml 10% SDS 46 ml H2O
Buffer elektroforesis: (1 liter), pH 8,3 3 g Tris
14,4 g glisin 1 g SDS
48 Larutan staining (pewarna):
0,1% Coomassie Brilliant Blue R-250 40% metanol
10% asam asetat glasial 50% air destilata
Larutan destaining (peluntur): 40% metanol
10% asam asetat glasial 50% air destilata
49 Lampiran 9. Data hasil pemurnian kromatografi Butyl sepharose FF
Fraksi Absorbansi (λ:280 nm) Fraksi Absorbansi (λ:280 nm) Fraksi Absorbansi (λ:280 nm) 1 0,027 26 0,046 51 0,002 2 0,028 27 0,043 52 0,004 3 0,029 28 0,041 53 0,005 4 0,093 29 0,015 54 0,006 5 0,148 30 0,014 55 0,007 6 0,073 31 0,013 56 0,008 7 0,031 32 0,012 57 0,01 8 0,02 33 0,012 58 0,012 9 0,017 34 0,011 59 0,013 10 0,016 35 0,012 60 0,014 11 0,016 36 0,014 61 0,015 12 0,016 37 0,016 62 0,017 13 0,017 38 0,018 63 0,018 14 0,017 39 0,025 64 0,021 15 0,018 40 0,056 65 0,004 16 0,018 41 0,137 66 0,002 17 0,019 42 0,081 67 0,002 18 0,02 43 0,057 68 0,002 19 0,02 44 0,047 69 0,001 20 0,026 45 0,036 70 0,001 21 0,096 46 0,029 22 0,088 47 0,025 23 0,068 48 0,004 24 0,057 49 0,002 25 0,05 50 0,002
50 Lampiran 10. Data hasil pemurnian kromatografi Sephacryl S-200HR
Fraksi Absorbansi (λ:280 nm) Fraksi Absorbansi (λ:280 nm) Fraksi Absorbansi (λ:280 nm) 1 0,026 26 0,038 51 0,073 2 0,028 27 0,039 52 0,082 3 0,029 28 0,04 53 0,085 4 0,03 29 0,041 54 0,086 5 0,03 30 0,042 55 0,087 6 0,03 31 0,043 56 0,089 7 0,032 32 0,044 57 0,091 8 0,064 33 0,048 58 0,055 9 0,054 34 0,049 59 0,055 10 0,048 35 0,05 60 0,054 11 0,032 36 0,05 61 0,054 12 0,033 37 0,051 62 0,058 13 0,034 38 0,052 63 0,059 14 0,035 39 0,052 64 0,06 15 0,035 40 0,052 65 0,061 16 0,035 41 0,052 66 0,063 17 0,035 42 0,057 67 0,064 18 0,036 43 0,058 68 0,067 19 0,038 44 0,062 69 0,06 20 0,045 45 0,065 70 0,057 21 0,052 46 0,078 71 0,04 22 0,061 47 0,076 72 0,033 23 0,05 48 0,076 73 0,028 24 0,048 49 0,075 74 0,02 25 0,043 50 0,072 75 0,018