BOGOR
2006
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul: Ekstraksi Vanili Secara Enzimatik dari Buah Vanili (Vanilla planifolia Andrews) Segar adalah karya saya sendiri dengan bimbingan Dr. Ir. Nuri Andarwulan, MS. dan Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono serta belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain, telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, November 2006
Indriana Satya Mintarti
Vanili (Vanilla Planifolia Andrews) Segar. Dibimbing oleh NURI ANDARWULAN dan MAGGY T. SUHARTONO.
Ekstrak vanili alami biasanya diproduksi menggunakan buah vanili kering yang telah mengalami kuring karena buah vanili segar tidak memiliki aroma. Selama proses kuring yang kompleks dan panjang terjadi berbagai aktivitas enzim alami dalam buah yang meliputi degradasi dinding sel serta pembentukan flavor vanilin dari glukovanilin oleh aktifitas enzim β-glukosidase.
Berdasarkan hal tersebut maka penelitian ini bertujuan untuk mengembangan metode ekstraksi vanili secara enzimatik langsung dari buah vanili (Vanilla Planifolia Andrews) segar untuk mereduksi biaya dan waktu karena glukovanilin dapat diekstrak dan secara bersamaan ditransformasi menjadi vanilin oleh kombinasi enzim yang berhubungan dengan degradasi dinding sel (selulase dan pektinase) dan hidrolisis glukovanilin (β-glukosidase). Selain itu, kadar vanilin sebagai komponen flavor utama bisa lebih tinggi dibanding ekstrak vanili kering serta persiapan sampel dengan pengeringan beku dilanjutkan penggilingan dapat mengoptimalkan kontak antara enzim dengan substrat.
Metode penelitian terdiri dari 5 tahap yaitu: (1) Karakterisasi kimia buah vanili segar dan kering, (2) Penentuan suhu inkubasi optimum enzim β- glukosidase, (3) Ekstraksi enzimatik buah vanili segar; (a) Satu jenis enzim komersial dengan pelarut air dan atau etanol serta (b) Dua atau tiga jenis enzim komersial dengan pelarut etanol, (4) Optimasi ekstraksi enzimatik; (a) Konsentrasi enzim serta (b) Waktu inkubasi enzim dan (5) Pengamatan terhadap kadar air, serat pangan, vanilin, glukosa dan padatan terlarut.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa vanili segar dan kering memiliki kadar air 83.50% dan 20.48%, vanilin 0.76%bk dan 1.63%bk serta serat pangan 10.17%bk dan 9.84%bk. Ekstrak vanili kering sebagai kontrol mengandung vanilin dan glukosa sebesar 3.28 dan 11.95%bk ekstrak. Suhu optimum bagi aktifitas enzim β-glukosidase adalah 500C yang menghasilkan kadar vanilin dan glukosa 16.18 dan 75.85%bk ekstrak. Untuk perlakuan dengan 1 jenis enzim komersial, kadar vanillin tertinggi dicapai dengan penambahan β- glukosidase+air +etanol yakni 15.97%bk ekstrak dan glukosa tertinggi dicapai dengan penambahan pektinase+air+etanol yakni 90.26%bk. Seluruh perlakuan dengan etanol menghasilkan kadar vanilin lebih tinggi dibanding air. Unt uk perlakuan dengan 2 atau 3 jenis enzim komersial, kadar vanilin ekstrak tertinggi dicapai dengan perlakuan pektinase+β-glukosidase yakni 7.56%bk ekstrak dan glukosa 90.26%bk ekstrak. Konsentrasi optimum aktifitas enzim β-glukosidase adalah 10 unit yang menghasilkan kadar vanillin dan glukosa 15.62 dan 73.95%bk ekstrak. Sedangkan waktu inkubasi optimumnya adalah 4 jam dengan kadar vanilin 15.04%bk dan glukosa 73.86%bk ekstrak.
Oleh sebab itu, ekstraksi terbaik diperoleh melalui penambahan β- glukosidase 10 unit terhadap 0.5901 g bk buah vanili segar menggunakan shaker water bath terkontrol 150 rpm pada suhu 500C selama 4 jam, yang selanjutnya ditambahkan etanol 47.5%v/v selama 30 menit. Kondisi ekstraksi ini mampu menghasilkan kadar vanilin 4.6 kali lebih tinggi dibanding metode ekstraksi konvensional yang menggunakan buah vanili kering.
INDRIANA SATYA MINTARTI
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada
Program Studi Ilmu Pangan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
NIM : F251034051
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Nuri Andarwulan, MS. Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono Ketua Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana Ilmu Pangan
Prof.Dr.Ir.Betty Sri Laksmi Jenie,MS. Prof.Dr.Ir.Khairil Anwar Notodiputro,MS.
penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul: ‘Ekstraksi Vanili Secara Enzimatik dari Buah Vanili (Vanilla planifolia Andrews) Segar’ dengan lancar. Penelitian ini berlangsung sejak Oktober 2005 sampai dengan Juli 2006.
Ungkapan terimakasih yang sebesar-besarnya penulis sampaikan bagi Ibu Dr. Ir. Nuri Andarwulan, MS dan Ibu Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono selaku pembimbing atas arahan dan dukungan yang begitu besar; Bapak Dr. Ir. Feri Kusnandar, MSc. selaku penguji atas saran dan masukannya. Disamping itu, penulis menyampaikan rasa terimakasih kepada Proyek Penelitian Ilmu Pengetahuan Dasar (Fundamental), Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional Tahun Anggaran 2006/2007 yang telah mensponsori penelitian, juga kepada Bapak Taufik dan Mbak Ari sebagai laboran di SEAFAST Center, IPB, Bapak Sobirin, Bapak Rojak beserta seluruh staf laboran Dept. Ilmu dan Teknologi Pangan, IPB, Bogor yang banyak membantu selama pengumpulan data serta Bapak Ir. Asep Rahmat MTP., Dr. Dede Zaenal Arif, MSc. beserta staf pengajar di Jurusan Teknologi Pangan, Fakultas Teknik, Universitas Pasundan, Bandung yang banyak memberikan saran dalam penelitian.
Penghargaan setinggi-tingginya kepada: Ayahanda dan Ibunda tercinta Drs. Karsono Minhar (Alm.) dan Yayat Suryati, SPd., yang tidak pernah putus mendukung penulis baik dari segi moril maupun materil untuk menuntaskan studi hingga jenjang ini; Adindaku Indriati SW. SPd. dan suami Juniar RS., SPd. atas doa dan motivasinya; Jerry A. sebagai teman bertukar pikiran dalam menghadapi masa- masa sulit dalam penyelesaian studi ini; A’ Obing, Q-bo, A’ Agus, Agus H., Hadie, Harry, Dani, Feri, Lala., Tri, Bu Yusphi, Hons dan teman-teman sekalian yang tidak mungkin disebut satu-persatu, atas segala bantuan dan motivasinya.
Akhir kata, atas segala kekurangan dari segi isi maupun cara penulisannya, penulis mohon maaf. Semoga tesis ini bermanfaat bagi siapa saja yang membacanya. Amien.
Bogor, November 2006
Drs. Karsono Minhar (Alm.) dan ibu Yayat Suryati, SPd. Penulis merupakan putri pertama dari 2 bersaudara.
Penulis berhasil menyelesaikan pendidikan Program D3 Akademi Gizi, Departemen Kesehatan RI, Bandung pada tahun 1999. Selanjutnya, pada tahun yang sama penulis mengikuti pendidikan S1 di Jurusan Teknologi Pangan, Fakultas Teknik, Universitas Pasundan, Bandung dan lulus pada tahun 2002. Pengalaman mengajar dimulai sejak tahun 2001 hingga 2003 sebagai assisten dosen mata kuliah Fisika Dasar I, Fisika Dasar II, Kimia Fisik dan Kimia Analitik di Jurusan Teknologi Pangan, Universitas Pasundan, Bandung. Selain itu juga pernah mengajar mata pelajaran Fisika sebagai tenaga honorer di SMUN I Ciniru, Kuningan pada tahun 2000. Pada tahun 2003, kembali melanjutkan pendidikan untuk memperdalam ilmu pangan, khususnya bidang kimia pangan di Institut Pertanian Bogor dengan penelitian akhir atas dukungan Proyek Penelitian Ilmu Pengetahuan Dasar (Fundamental), Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional Tahun Anggaran 2006/2007.
DAFTAR TABEL ……….. ix
DAFTAR GAMBAR ………... x
DAFTAR LAMPIRAN ... xii
PENDAHULUAN ………... 1 Latar Belakang ...………... 1 Perumusan Masalah ...………... 3 Kerangka Pemikiran ...………... 4 Tujuan Penelitian ...……….... 8 Hipotesis ...…………....………... 8 Manfaat Penelitian ...……...……….... 9 TINJAUAN PUSTAKA ………... 10
Tinjauan Statistik Komoditas Vanili Di Indonesia ... 10 Botani, Struktur dan Senyawa Kimiawi Penyusun Buah Vanili ... 14 Prekursor dan Enzim Pembentuk Vanilin .……….... 17 Reaksi Enzimatik Selama Proses Kuring ………. 21 Ekstraksi Buah Vanili ... 22 BAHAN DAN METODE PENELITIAN ...………... 34 Tempat dan Waktu Penelitian ………... 34
Bahan dan Alat ……….. 34
Prosedur Penelitian ……….... 36 HASIL DAN PEMBAHASAN ... 47
Karakterisasi Kimia Buah Vanili Segar dan Kering ... 47 Penentuan Suhu Inkubasi Optimum Enzim β-Glukosidase ... 50 Ekstraksi Enzimatik Buah Vanili Segar ... 56 Optimasi Ekstraksi Enzimatik ... 69 KESIMPULAN DAN SARAN ……….. 74
DAFTAR PUSTAKA ………. 76 LAMPIRAN ... 83
1 Rekapitulasi perlakuan 1 jenis enzim komersial dengan pelarut
air dan atau etanol untuk ekstraksi ... 39 2 Rekapitulasi perlakuan 2 atau 3 jenis enzim komersial dengan
pelarut air dan etanol untuk ekstraksi ... 40 3 Data dasar buah vanili segar dan kering hasil pengeringan
1 Reaksi hidrolisis glukovanilin oleh enzim β-glukosidase………... 6 2 Ekspor dan impor komoditas vanili di Indonesia pada tahun
1999-2003 ... 10 3 Bentuk ekspor dan impor komoditas vanili di Indonesia pada
tahun 1999-2003 ... 11 4 Luas areal perkebunan vanilli berdasarkan status pengusahaan
di Indonesia pada tahun 1999-2003 ... 12 5 Produksi vanili kering berdasarkan status pengusahaan di
Indonesia pada tahun 1999-2003 ... 13 6 Harga vanili segar di pasar dalam negeri pada tahun 1997-2001 .. 13 7 Bunga serta buah vanili mentah (a) dan buah vanili matang (b) .... 14 8 Buah vanili kering ……….………... 16 9 Struktur kimia vanilin ……..………... 17 10 Komposisi bagian dalam buah vanili dengan potongan melintang
pembesaran 20 kali ... 19 11 Potongan melintang buah vanili hijau dengan pembesaran
400 kali ...………..………. 20 12 Transformasi glukovanilin dan vanilin ………... 22 13 Ekstraksi vanili dengan metode perkolasi ……….. 24 14 Struktur selulosa ………. 26 15 Skema tahapan dalam selulolisis …..………... 26 16 Struktur kimia pektin …..………... 29 17 Wilayah smooth homopolimer termetilasi pektin ………... 30 18 Wilayah non-gelling hairy pektin ………..……… 30 19 Model induced fit Koshland ………... 32 20 Buah Vanilla planifolia Andrews segar (a) dan kering (b)... 35 21 Diagram alir tahapan penelitian ………. 36 22 Vanili kering (a) dan segar (b) hasil pengeringan beku ... 47 23 Penentuan suhu inkubasi optimum enzim β-glukosidase ... 50 24 Ekstrak vanili segar yang diperoleh dengan perlakuan ekstraksi
pada suhu inkubasi enzim β-glukosidase yang berbeda ... 53 25 Kadar vanilin dan glukosa ekstrak buah vanili kering (kontrol)
26 Ekstrak buah vanili segar dengan penambahan satu jenis enzim komersial dengan pelarut air dan atau etanol, dari kiri ke kanan: air, air+etanol, selulase+air selulase+air+etanol, pektinase+air, pektinase+air+etanol, β-glukosidase+air,
β-glukosidase+air+etanol ... 64 27 Kadar vanilin dan glukosa ekstrak buah vanili kering (kontrol)
dan vanili segar dengan penambahan 2 atau 3 jenis enzim
komersial dengan pelarut air+etanol ... 65 28 Padatan terlarut ekstrak vanili segar, dari kiri ke kanan: selulase+
pektinase, selulase+β-glukosidase, pektinase
+β-glukosidase, selulase+pektinase+β-glukosidase, β-glukosidase. 66 29 Ekstrak vanili segar dengan penambahan 2 atau 3 jenis enzim
komersial dengan pelarut air+etanol, dari kiri ke kanan: selulase+pektinase, selulase+β-glukosidase,
pektinase+β-glukosidase, selulase+pektinase+β-glukosidase ... 68 30 Penentuan konsentrasi optimum enzim β-glukosidase ... 69 30 Ekstrak vanili segar dengan konsentrasi enzim β-glukosidase
yang berbeda ... 71 32 Penentuan waktu inkubasi optimum enzim β-glukosidase ... 71 33 Ekstrak vanili segar dengan waktu inkubasi enzim β-glukosidase
yang berbeda ... 73
1 Data dasar buah vanili segar dan kering ... 83 2 Kurva standar vanilin dan glukosa ………. 83 3 Kadar vanilin ekstrak buah vanili segar dalam penentuan suhu
inkubasi optimum enzim β-glukosidase ……… 85 4 Kadar glukosa ekstrak buah vanili segar dalam penentuan suhu
inkubasi optimum enzim β-glukosidase ………. 86 5 Kadar vanilin ekstrak buah vanili kering dan segar dengan
penambahan 1 jenis enzim komersial ………. 88 6 Kadar glukosa ekstrak vanili kering dan segar dengan
penambahan 1 jenis enzim komersial ………. 90 7 Kadar vanilin ekstrak buah vanili segar dengan
penambahan 2 atau 3 jenis enzim komersial ……….. 93 8 Kadar glukosa ekstrak buah vanili segar dengan penambahan 2
atau 3 jenis enzim komersial ………... 94 9 Kadar vanilin ekstrak buah vanili segar dalam penentuan
konsentrasi optimum enzim β-glukosidase .……… 96 10 Kadar glukosa ekstrak buah vanili segar dalam penentuan
konsentrasi optimum enzim β-glukosidase ……… 98 11 Kadar vanilin ekstrak buah vanili segar dalam penentuan waktu
inkubasi optimum enzim β-glukosidase .……… 99 12 Kadar glukosa ekstrak buah vanili segar dalam penentuan waktu
PENDAHULUAN
LATAR BELAKANG
Vanili adalah tanaman tropis bernilai ekonomi tinggi karena merupakan rempah termahal kedua yang diperdagangkan di dunia internasional. Harga vanili segar rata-rata di pasar dalam negeri dari tahun 1999 sampai 2003 naik turun, dimana pada tahun 2003 harga vanili segar melonjak tajam mencapai Rp.301.330/kg. Sedangkan harga vanili kering pada tahun 2002 cukup tinggi berkisar Rp.2.000.000 hingga Rp.3.000.000/kg (Deptan 2004). Informasi harga terakhir (tahun 2006) yang diperoleh dari para petani di Kuningan dan Sumedang adalah Rp.65.000/kg untuk vanili segar dan Rp.700.000/kg untuk vanili kering.
Berdasarkan data Biro Pusat Statistik (BPS) yang diolah Deptan (2004), sejak tahun 2001 sampai 2003, areal terluas yang digunakan untuk tana man vanili terdapat di provinsi Sulawesi Utara, Sulawesi Selatan dan Nusa Tenggara Timur, dimana mayoritas berstatus Perkebunan Rakyat (PR). Produksi vanili kering yang mayoritas merupakan PR tersebut mengalami peningkatan, dari 1.791 ton pada tahun 1999 menjadi 1.680 ton tahun 2000, 2.196 ton tahun 2001 dan 2.730 ton tahun 2002.
Sementara itu, ekspor vanili kering dari tahun 1999 sampai tahun 2002 terus meningkat dan berdasarkan data sementara pada tahun 2003 melonjak tajam hingga mencapai 6.363 ton dengan nilai 19.275.000 US$. Meski demikian, nilai ekspor vanili turun naik sesuai dengan harga yang berlaku dipasaran, dipengaruhi oleh ketersediaan barang, besarnya permintaan serta mutu barang. Pada tahun 2003, tiga negara tujuan ekspor terbesar dalam bentuk kering utuh (whole bean) adalah Cina, Amerika Serikat dan Jerman. Sedangkan untuk ekspor olahan vanili kering (other vanilla) adalah Amerika Serikat, Korea dan Singapura.
Berdasarkan data dari Trade Centre of the United Nation Conference in Trade and Development/World Trade Organization (UNCTAD/WTO) (2002), diacu dalam Furth dan Cox (2004), Indonesia termasuk negara terbesar disamping Madagaskar dan Uganda yang memproduksi dan mengekspor vanili sehingga memenuhi kebutuhan pasar dunia. Walaupun demikian, Indonesia masih mengimpor vanili dalam bentuk kering utuh dan olahan vanili kering berupa ekstrak vanili, oleoresin, bubuk dan lain- lain, yang digunakan untuk memenuhi
kebutuhan dalam negeri dan sebagian lainnya diekspor kembali. Hingga saat ini, Indonesia belum mampu memproduksi bentuk olahan vanili kering secara maksimal sehingga permintaan dalam negeri terhadap produk-produk tersebut masih tergantung pada negara pengimpor seperti Korea, Amerika Serikat dan Papua New Giunea. Hal ini kemungkinan besar disebabkan vanili kering di Indonesia masih memiliki kualitas rendah dibanding potensi sebenarnya akibat pemanenan buah belum cukup tua serta proses kuring yang kurang sempurna. Diketahui bahwa vanili kering Indonesia memiliki flavor woody dan burn
sehingga kualitas ekstrak vanili alami pun menjadi rendah (Zahorik, 2006).
Ekstrak vanili merupakan salah satu bentuk vanili olahan yang lebih mudah dan luas penggunaannya. Ekstrak vanili digunakan di seluruh dunia sebagai
flavouring agent dessert, like baked goods, es krim, minuman dan custard. Selain itu ekstrak vanili digunakan oleh industri selain pangan seperti parfum, obat- obatan dan kosmetik (de Guzman dan Siemonsma 1999).
Permintaan yang tinggi akan ekstrak vanili menyebabkan diproduksinya vanilin sintetik yang berasal dari eugenol (minyak cengkeh), lignin (limbah bubur kertas) dan guaiakol (petrokimia). Meskipun ekstrak vanili alami masih digunakan oleh industri pangan, namun jumlahnya kurang dari 1% produksi vanilin. Sisanya sebesar 99% diperoleh melalui jalur sintetik. Hal ini disebabkan harga ekstrak vanili alami lebih mahal (sekitar 2.75 US$/oz single fold), akibat metode penyerbukan yang digunakan adalah penyerbukan menggunakan tangan, waktu antara penyerbukan dan pemanenan yang panjang, serta proses kuring dan metode ekstraksi yang lama juga kompleks (http://www.uyseg.org/greener_industry/ pages/vanilin/1Vanilin_AP.htm 2005). Akan tetapi, akhir-akhir ini terjadi kecenderungan dimana konsumen lebih menyukai ekstrak vanili alami dengan alasan flavor yang lebih kaya dan sempurna karena adanya p- hidroksi benzaldehid dan p- hidroksi benzil metil eter serta 130 komponen lainnya, disamping vanilin sebagai komponen utama (98%) (http://www.ang.kfunigraz.ac.at/~katzer/engl/Vani_pla.html 2005). Senyawa- senyawa inilah yang mendukung terbentuknya flavor alami lembut, yang tidak dimiliki vanilin sintetik dengan flavornya yang heavy, grassy odor dan bitter aftertaste (Reineciuss 1994).
Pada level industri, ekstrak vanili alami diproses dengan metode konvensional (maserasi atau perkolasi) selama sekitar 1 bulan menggunakan buah yang telah melalui proses kuring karena buah vanili segar tidak memiliki aroma. Proses kuring dimulai 1 minggu setelah pane n yang terdiri dari killing, sweating
(fermenting), drying dan conditioning. Seluruh proses ini memakan waktu kurang lebih 5 bulan hingga dihasilkan vanili kering (cured vanilla) (Deptan 2004). Proses fermentasi yang panjang merubah beberapa glukosida menjadi glukosa, vanilin dan kompleks flavor lainnya. Glukosida dengan jumlah tertinggi adalah glukovanilin yang menghasilkan vanilin oleh aktifitas enzim β-glukosidase.
Berdasarkan hal- hal yang disebutkan di atas, penelitian ini dilakukan sebagai upaya pengembangan metode ekstraksi secara enzimatik langsung dari buah vanili segar, untuk mereduksi biaya karena harga vanili segar dan biaya produksi lebih murah serta untuk mereduksi waktu karena glukovanilin dapat langsung diekstrak dari buah vanili segar dan secara bersamaan ditransformasi menjadi vanilin oleh kombinasi enzim yang berhubungan dengan degradasi dinding sel (selulase dan pektinase komersial) dan hidrolisis glukovanilin (β-glukosidase komersial). Selain itu, kadar vanilin yang dihasilkan pun bisa lebih tinggi dibanding ekstrak vanili kering akibat digunakannya β-glukosidase komersial serta metode persiapan sampel buah vanili segar dengan cara pengeringan beku dilanjutkan dengan penggilingan menyebabkan interaksi enzim dengan substrat lebih optimum.
PERUMUSAN MASALAH
Ekstrak vanili alami yang selama ini diproduksi pada umumnya menggunakan buah vanili kering yang telah mengalami proses kuring dengan metode ekstraksi vanili secara maserasi atau perkolasi selama kurang lebih 1 bulan. Proses kuring sendiri membutuhkan waktu sekitar 5 bulan, yang terdiri dari
killing, sweating (fermenting), drying dan conditioning. Selama kuring terjadi berbagai aktifitas enzim alami dalam buah vanili yang meliputi degradasi dinding sel serta pembentukan flavor vanilin dari glukovanilin oleh aktifitas enzim β- glukosidase. Proses kuring dan ekstraksi vanili yang kompleks dan panjang menyebabkan harga ekstrak vanili alami begitu mahal. Sebagai alternatif pemecahan masalah ini, maka dilakukan pengembangan metode ekstraksi secara
enzimatik (menggunakan enzim-enzim hidrolitik komersial) terhadap buah vanili segar yang telah mengalami persiapan sampel dengan cara pengeringan beku dilanjutkan dengan penggilingan.
Masalah yang diteliti adalah pengaruh penggunaan enzim selulase, pektinase dan β-glukosidase komersial serta pelarut yakni air dan atau etanol, serta efek sinergisme ketiga enzim komersial tersebut terhadap kadar vanilin dan glukosa yang dihasilkan dalam ekstrak vanili dari buah vanili segar. Disamping itu, penentuan konsentrasi, waktu dan suhu inkubasi enzim yang diperlukan hingga kadar vanilin bebas dalam ekstrak mencapai batas optimum, merupakan tahapan- tahapan kritis yang harus diketahui dalam pengembangan metode ekstraksi enzimatik.
KERANGKA PEMIKIRAN
Pada level industri, ekstrak vanili alami umumnya diproses menggunakan buah vanili kering yang telah melalui proses kuring karena buah vanili segar tidak memiliki aroma. Proses kuring dapat dilakukan dengan beberapa cara, tapi pada prinsipnya metode kuring yang dilakukan di Indonesia tidak jauh berbeda dengan metode kuring klasik yang dilakukan di negara- negara lainnya seperti Madagaskar dan Meksiko. Tahap pertama adalah killing dengan mencelupkan vanili segar ke dalam air panas 650C selama 2-3 menit. Setelah itu dilakukan pemeraman (sweating atau fermenting) selama 48 jam agar terjadi reaksi enzimatik dalam buah untuk pembentukan aroma, dimana pada tahap ini β-glukosidase mengubah glukovanilin menjadi vanilin dan glukosa. Tempat fermentasi terbuat dari peti kayu yang dilapisi serbuk gergaji atau styrofoam untuk mempertahankan suhu 38- 400C. Tahap selanjutnya adalah pengeringan (drying) dengan sinar matahari selama 10-20 hari dari jam 8.00-10.00, lalu dibungkus kain hitam dan dijemur kembali jam 14.00-15.00 dan dibungkus lagi pada malam harinya. Setelah itu dilakukan pengeringan lambat dengan suhu 28-290C dan kelembaban 80% selama 30-35 hari. Tahap terakhir adalah pemantapan aroma (conditioning) dengan menyimpan vanili di dalam kotak kering selama 2-3 bulan (Deptan 2004).
Buah vanili segar tidak memiliki aroma karena vanilin yang merupakan komponen flavor utama masih terikat sebagai glukosida dan harus dibebaskan
melalui reaksi enzimatik. Goris (1947), diacu dalam Purseglove et al. (1981), menemukan bahwa vanili segar mengandung paling sedikit 4 glukosida yang menghasilkan vanilin dan komponen flavor lainnya. Glukosida dengan jumlah tertinggi adalah glukovanilin. Selanjutnya glukovanililalkohol ditemukan dalam jumlah yang lebih sedikit, diikuti oleh glukosida dari asam protokatekuat (asam 3,4-dihidroksi benzoat).
Adanya enzim hidrolitik yang dapat memecah glukovanilin menjadi vanilin pertama kali dicatat oleh Lecompt tahun 1913 yang didukung oleh Arana tahun 1943 yang menyatakan itu sebagai β-glukosidase. Beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa prekursor flavor terutama terakumulasi dalam jaringan plasenta di sekeliling biji, dimana biji dan dinding buah bagian luar tidak mengandung glukovanilin (Havkin-Frenkel et al. 2004; Kuras et al. 1999, diacu dalam Odoux et al. 2003; Odoux et al. 2003). Aktifitas enzim β-glukosidase sendiri beberapa kali lebih tinggi dalam dinding buah bagian luar dari pada dalam jaringan plasenta dan glandular selrambut (Havkin-Frenkel et al. 2004). Bahkan Arana (1943) diacu dalam Odoux et al. (2003), menyatakan bahwa β-glukosidase terdapat dalam dinding buah bagian luar, sedangkan jaringan plasenta sama sekali tidak mengandung aktifitas β-glukosidase. Artinya bahwa enzim dan substrat terdapat dalam lokasi yang berbeda dalam buah, sehingga proses kuring berfungsi memicu terjadinya difusi glukovanilin dari bagian pusat ke permukaan buah. Di sisi lain, menurut Odoux et al. (2003), β-glukosidase terutama berlokasi dalam lamina plasenta dan dengan jumlah yang lebih sedikit terdapat dalam papila. Enzim dan substrat terdapat dalam jaringan yang sama, meskipun mungkin terdapat dalam 2 bagian berbeda di dalam sel (sitoplasma dan atau periplasma untuk β-glukosidase dan vakuola untuk glukovanilin). Hal inilah yang menyebabkan mengapa kuring perlu dilakukan. Hidrolisis glukovanilin yang terjadi pada tahap pematangan lambat ketika buah menjadi hitam dan pada tahap awal kuring, dapat disebabkan adanya perubahan tonoplas sehingga membran sitoplasma dan dinding sel bersatu. Pada Gambar 1 ditunjukkan reaksi hidrolisis yang terjadi pada glukovanilin oleh β-glukosidase (http://www.uyseg.org/greener_industry/ pages/vanilin/1Vanilin_AP.htm 2005).
hidrolisis
H
CHO
cincin H O-CH3 vanilin
glukosa
Gambar 1 Reaksi hidrolisis glukovanilin oleh enzim β-glukosidase
Metode ekstraksi menggunakan buah vanili kering telah banyak dikembangkan. Dua metode yang paling banyak digunakan adalah metode maserasi dan perkolasi. Cowley (1973), menggunakan metode perkolasi menggunakan buah vanili kering yang diawali dengan pemotongan buah vanili dan pencampuran gula untuk meningkatkan viskositas, membantu memperkuat dan menahan senyawa aromatik, meningkatkan warna serta memperpanjang umur simpan. Selanjutnya dilakukan perkolasi (sirkulasi) menggunakan campuran etanol dan air selama 3 sampai 4 minggu. Kemudian dilakukan aging, sentrifugasi dan filtrasi hingga diperoleh ekstrak vanili. Metode yang lebih modern adalah maserasi yakni dengan menempatkan buah vanili kering dalam maserator yang dilengkapi pengaduk selama 1 sampai 3 bulan dengan penambahan etanol 60% (Purseglove et al. 1981).
Disisi lain, penggunaan buah vanili segar sebagai bahan baku pembuatan ekstrak sebenarnya telah dilakukan oleh industri- industri besar, meski waktu yang