INDRIANA SATYA MINTARTI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul: Ekstraksi Vanili Secara Enzimatik dari Buah Vanili (Vanilla planifolia Andrews) Segar adalah karya saya sendiri dengan bimbingan Dr. Ir. Nuri Andarwulan, MS. dan Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono serta belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain, telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Vanili (Vanilla Planifolia Andrews) Segar. Dibimbing oleh NURI ANDARWULAN dan MAGGY T. SUHARTONO.
Ekstrak vanili alami biasanya diproduksi menggunakan buah vanili kering yang telah mengalami kuring karena buah vanili segar tidak memiliki aroma. Selama proses kuring yang kompleks dan panjang terjadi berbagai aktivitas enzim alami dalam buah yang meliputi degradasi dinding sel serta pembentukan flavor vanilin dari glukovanilin oleh aktifitas enzim β-glukosidase.
Berdasarkan hal tersebut maka penelitian ini bertujuan untuk mengembangan metode ekstraksi vanili secara enzimatik langsung dari buah vanili (Vanilla Planifolia Andrews) segar untuk mereduksi biaya dan waktu karena glukovanilin dapat diekstrak dan secara bersamaan ditransformasi menjadi vanilin oleh kombinasi enzim yang berhubungan dengan degradasi dinding sel (selulase dan pektinase) dan hidrolisis glukovanilin (β-glukosidase). Selain itu, kadar vanilin sebagai komponen flavor utama bisa lebih tinggi dibanding ekstrak vanili kering serta persiapan sampel dengan pengeringan beku dilanjutkan penggilingan dapat mengoptimalkan kontak antara enzim dengan substrat.
Metode penelitian terdiri dari 5 tahap yaitu: (1) Karakterisasi kimia buah vanili segar dan kering, (2) Penentuan suhu inkubasi optimum enzim β -glukosidase, (3) Ekstraksi enzimatik buah vanili segar; (a) Satu jenis enzim komersial dengan pelarut air dan atau etanol serta (b) Dua atau tiga jenis enzim komersial dengan pelarut etanol, (4) Optimasi ekstraksi enzimatik; (a) Konsentrasi enzim serta (b) Waktu inkubasi enzim dan (5) Pengamatan terhadap kadar air, serat pangan, vanilin, glukosa dan padatan terlarut.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa vanili segar dan kering memiliki kadar air 83.50% dan 20.48%, vanilin 0.76%bk dan 1.63%bk serta serat pangan 10.17%bk dan 9.84%bk. Ekstrak vanili kering sebagai kontrol mengandung vanilin dan glukosa sebesar 3.28 dan 11.95%bk ekstrak. Suhu optimum bagi aktifitas enzim β-glukosidase adalah 500C yang menghasilkan kadar vanilin dan glukosa 16.18 dan 75.85%bk ekstrak. Untuk perlakuan dengan 1 jenis enzim komersial, kadar vanillin tertinggi dicapai dengan penambahan β -glukosidase+air +etanol yakni 15.97%bk ekstrak dan glukosa tertinggi dicapai dengan penambahan pektinase+air+etanol yakni 90.26%bk. Seluruh perlakuan dengan etanol menghasilkan kadar vanilin lebih tinggi dibanding air. Unt uk perlakuan dengan 2 atau 3 jenis enzim komersial, kadar vanilin ekstrak tertinggi dicapai dengan perlakuan pektinase+β-glukosidase yakni 7.56%bk ekstrak dan glukosa 90.26%bk ekstrak. Konsentrasi optimum aktifitas enzim β-glukosidase adalah 10 unit yang menghasilkan kadar vanillin dan glukosa 15.62 dan 73.95%bk ekstrak. Sedangkan waktu inkubasi optimumnya adalah 4 jam dengan kadar vanilin 15.04%bk dan glukosa 73.86%bk ekstrak.
INDRIANA SATYA MINTARTI
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada
Program Studi Ilmu Pangan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
NIM : F251034051
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Nuri Andarwulan, MS. Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono Ketua Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana Ilmu Pangan
Prof.Dr.Ir.Betty Sri Laksmi Jenie,MS. Prof.Dr.Ir.Khairil Anwar Notodiputro,MS.
penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul: ‘Ekstraksi Vanili Secara Enzimatik dari Buah Vanili (Vanilla planifolia Andrews) Segar’ dengan lancar. Penelitian ini berlangsung sejak Oktober 2005 sampai dengan Juli 2006.
Ungkapan terimakasih yang sebesar-besarnya penulis sampaikan bagi Ibu Dr. Ir. Nuri Andarwulan, MS dan Ibu Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono selaku pembimbing atas arahan dan dukungan yang begitu besar; Bapak Dr. Ir. Feri Kusnandar, MSc. selaku penguji atas saran dan masukannya. Disamping itu, penulis menyampaikan rasa terimakasih kepada Proyek Penelitian Ilmu Pengetahuan Dasar (Fundamental), Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional Tahun Anggaran 2006/2007 yang telah mensponsori penelitian, juga kepada Bapak Taufik dan Mbak Ari sebagai laboran di SEAFAST Center, IPB, Bapak Sobirin, Bapak Rojak beserta seluruh staf laboran Dept. Ilmu dan Teknologi Pangan, IPB, Bogor yang banyak membantu selama pengumpulan data serta Bapak Ir. Asep Rahmat MTP., Dr. Dede Zaenal Arif, MSc. beserta staf pengajar di Jurusan Teknologi Pangan, Fakultas Teknik, Universitas Pasundan, Bandung yang banyak memberikan saran dalam penelitian.
Penghargaan setinggi-tingginya kepada: Ayahanda dan Ibunda tercinta Drs. Karsono Minhar (Alm.) dan Yayat Suryati, SPd., yang tidak pernah putus mendukung penulis baik dari segi moril maupun materil untuk menuntaskan studi hingga jenjang ini; Adindaku Indriati SW. SPd. dan suami Juniar RS., SPd. atas doa dan motivasinya; Jerry A. sebagai teman bertukar pikiran dalam menghadapi masa- masa sulit dalam penyelesaian studi ini; A’ Obing, Q-bo, A’ Agus, Agus H., Hadie, Harry, Dani, Feri, Lala., Tri, Bu Yusphi, Hons dan teman-teman sekalian yang tidak mungkin disebut satu-persatu, atas segala bantuan dan motivasinya.
Akhir kata, atas segala kekurangan dari segi isi maupun cara penulisannya, penulis mohon maaf. Semoga tesis ini bermanfaat bagi siapa saja yang membacanya. Amien.
Bogor, November 2006
Drs. Karsono Minhar (Alm.) dan ibu Yayat Suryati, SPd. Penulis merupakan putri pertama dari 2 bersaudara.
DAFTAR TABEL ……….. ix
DAFTAR GAMBAR ………... x
DAFTAR LAMPIRAN ... xii
PENDAHULUAN ………... 1
Latar Belakang ...………... 1
Perumusan Masalah ...………... 3
Kerangka Pemikiran ...………... 4
Tujuan Penelitian ...……….... 8
Hipotesis ...…………....………... 8
Manfaat Penelitian ...……...……….... 9
TINJAUAN PUSTAKA ………... 10
Tinjauan Statistik Komoditas Vanili Di Indonesia ... 10
Botani, Struktur dan Senyawa Kimiawi Penyusun Buah Vanili ... 14
Prekursor dan Enzim Pembentuk Vanilin .……….... 17
Reaksi Enzimatik Selama Proses Kuring ………. 21
Ekstraksi Buah Vanili ... 22
BAHAN DAN METODE PENELITIAN ...………... 34
Tempat dan Waktu Penelitian ………... 34
Bahan dan Alat ……….. 34
Prosedur Penelitian ……….... 36
HASIL DAN PEMBAHASAN ... 47
Karakterisasi Kimia Buah Vanili Segar dan Kering ... 47
Penentuan Suhu Inkubasi Optimum Enzim β-Glukosidase ... 50
Ekstraksi Enzimatik Buah Vanili Segar ... 56
Optimasi Ekstraksi Enzimatik ... 69
1 Rekapitulasi perlakuan 1 jenis enzim komersial dengan pelarut
air dan atau etanol untuk ekstraksi ... 39 2 Rekapitulasi perlakuan 2 atau 3 jenis enzim komersial dengan
pelarut air dan etanol untuk ekstraksi ... 40 3 Data dasar buah vanili segar dan kering hasil pengeringan
INDRIANA SATYA MINTARTI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul: Ekstraksi Vanili Secara Enzimatik dari Buah Vanili (Vanilla planifolia Andrews) Segar adalah karya saya sendiri dengan bimbingan Dr. Ir. Nuri Andarwulan, MS. dan Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono serta belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain, telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Vanili (Vanilla Planifolia Andrews) Segar. Dibimbing oleh NURI ANDARWULAN dan MAGGY T. SUHARTONO.
Ekstrak vanili alami biasanya diproduksi menggunakan buah vanili kering yang telah mengalami kuring karena buah vanili segar tidak memiliki aroma. Selama proses kuring yang kompleks dan panjang terjadi berbagai aktivitas enzim alami dalam buah yang meliputi degradasi dinding sel serta pembentukan flavor vanilin dari glukovanilin oleh aktifitas enzim β-glukosidase.
Berdasarkan hal tersebut maka penelitian ini bertujuan untuk mengembangan metode ekstraksi vanili secara enzimatik langsung dari buah vanili (Vanilla Planifolia Andrews) segar untuk mereduksi biaya dan waktu karena glukovanilin dapat diekstrak dan secara bersamaan ditransformasi menjadi vanilin oleh kombinasi enzim yang berhubungan dengan degradasi dinding sel (selulase dan pektinase) dan hidrolisis glukovanilin (β-glukosidase). Selain itu, kadar vanilin sebagai komponen flavor utama bisa lebih tinggi dibanding ekstrak vanili kering serta persiapan sampel dengan pengeringan beku dilanjutkan penggilingan dapat mengoptimalkan kontak antara enzim dengan substrat.
Metode penelitian terdiri dari 5 tahap yaitu: (1) Karakterisasi kimia buah vanili segar dan kering, (2) Penentuan suhu inkubasi optimum enzim β -glukosidase, (3) Ekstraksi enzimatik buah vanili segar; (a) Satu jenis enzim komersial dengan pelarut air dan atau etanol serta (b) Dua atau tiga jenis enzim komersial dengan pelarut etanol, (4) Optimasi ekstraksi enzimatik; (a) Konsentrasi enzim serta (b) Waktu inkubasi enzim dan (5) Pengamatan terhadap kadar air, serat pangan, vanilin, glukosa dan padatan terlarut.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa vanili segar dan kering memiliki kadar air 83.50% dan 20.48%, vanilin 0.76%bk dan 1.63%bk serta serat pangan 10.17%bk dan 9.84%bk. Ekstrak vanili kering sebagai kontrol mengandung vanilin dan glukosa sebesar 3.28 dan 11.95%bk ekstrak. Suhu optimum bagi aktifitas enzim β-glukosidase adalah 500C yang menghasilkan kadar vanilin dan glukosa 16.18 dan 75.85%bk ekstrak. Untuk perlakuan dengan 1 jenis enzim komersial, kadar vanillin tertinggi dicapai dengan penambahan β -glukosidase+air +etanol yakni 15.97%bk ekstrak dan glukosa tertinggi dicapai dengan penambahan pektinase+air+etanol yakni 90.26%bk. Seluruh perlakuan dengan etanol menghasilkan kadar vanilin lebih tinggi dibanding air. Unt uk perlakuan dengan 2 atau 3 jenis enzim komersial, kadar vanilin ekstrak tertinggi dicapai dengan perlakuan pektinase+β-glukosidase yakni 7.56%bk ekstrak dan glukosa 90.26%bk ekstrak. Konsentrasi optimum aktifitas enzim β-glukosidase adalah 10 unit yang menghasilkan kadar vanillin dan glukosa 15.62 dan 73.95%bk ekstrak. Sedangkan waktu inkubasi optimumnya adalah 4 jam dengan kadar vanilin 15.04%bk dan glukosa 73.86%bk ekstrak.
INDRIANA SATYA MINTARTI
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada
Program Studi Ilmu Pangan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
NIM : F251034051
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Nuri Andarwulan, MS. Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono Ketua Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana Ilmu Pangan
Prof.Dr.Ir.Betty Sri Laksmi Jenie,MS. Prof.Dr.Ir.Khairil Anwar Notodiputro,MS.
penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul: ‘Ekstraksi Vanili Secara Enzimatik dari Buah Vanili (Vanilla planifolia Andrews) Segar’ dengan lancar. Penelitian ini berlangsung sejak Oktober 2005 sampai dengan Juli 2006.
Ungkapan terimakasih yang sebesar-besarnya penulis sampaikan bagi Ibu Dr. Ir. Nuri Andarwulan, MS dan Ibu Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono selaku pembimbing atas arahan dan dukungan yang begitu besar; Bapak Dr. Ir. Feri Kusnandar, MSc. selaku penguji atas saran dan masukannya. Disamping itu, penulis menyampaikan rasa terimakasih kepada Proyek Penelitian Ilmu Pengetahuan Dasar (Fundamental), Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional Tahun Anggaran 2006/2007 yang telah mensponsori penelitian, juga kepada Bapak Taufik dan Mbak Ari sebagai laboran di SEAFAST Center, IPB, Bapak Sobirin, Bapak Rojak beserta seluruh staf laboran Dept. Ilmu dan Teknologi Pangan, IPB, Bogor yang banyak membantu selama pengumpulan data serta Bapak Ir. Asep Rahmat MTP., Dr. Dede Zaenal Arif, MSc. beserta staf pengajar di Jurusan Teknologi Pangan, Fakultas Teknik, Universitas Pasundan, Bandung yang banyak memberikan saran dalam penelitian.
Penghargaan setinggi-tingginya kepada: Ayahanda dan Ibunda tercinta Drs. Karsono Minhar (Alm.) dan Yayat Suryati, SPd., yang tidak pernah putus mendukung penulis baik dari segi moril maupun materil untuk menuntaskan studi hingga jenjang ini; Adindaku Indriati SW. SPd. dan suami Juniar RS., SPd. atas doa dan motivasinya; Jerry A. sebagai teman bertukar pikiran dalam menghadapi masa- masa sulit dalam penyelesaian studi ini; A’ Obing, Q-bo, A’ Agus, Agus H., Hadie, Harry, Dani, Feri, Lala., Tri, Bu Yusphi, Hons dan teman-teman sekalian yang tidak mungkin disebut satu-persatu, atas segala bantuan dan motivasinya.
Akhir kata, atas segala kekurangan dari segi isi maupun cara penulisannya, penulis mohon maaf. Semoga tesis ini bermanfaat bagi siapa saja yang membacanya. Amien.
Bogor, November 2006
Drs. Karsono Minhar (Alm.) dan ibu Yayat Suryati, SPd. Penulis merupakan putri pertama dari 2 bersaudara.
DAFTAR TABEL ……….. ix
DAFTAR GAMBAR ………... x
DAFTAR LAMPIRAN ... xii
PENDAHULUAN ………... 1
Latar Belakang ...………... 1
Perumusan Masalah ...………... 3
Kerangka Pemikiran ...………... 4
Tujuan Penelitian ...……….... 8
Hipotesis ...…………....………... 8
Manfaat Penelitian ...……...……….... 9
TINJAUAN PUSTAKA ………... 10
Tinjauan Statistik Komoditas Vanili Di Indonesia ... 10
Botani, Struktur dan Senyawa Kimiawi Penyusun Buah Vanili ... 14
Prekursor dan Enzim Pembentuk Vanilin .……….... 17
Reaksi Enzimatik Selama Proses Kuring ………. 21
Ekstraksi Buah Vanili ... 22
BAHAN DAN METODE PENELITIAN ...………... 34
Tempat dan Waktu Penelitian ………... 34
Bahan dan Alat ……….. 34
Prosedur Penelitian ……….... 36
HASIL DAN PEMBAHASAN ... 47
Karakterisasi Kimia Buah Vanili Segar dan Kering ... 47
Penentuan Suhu Inkubasi Optimum Enzim β-Glukosidase ... 50
Ekstraksi Enzimatik Buah Vanili Segar ... 56
Optimasi Ekstraksi Enzimatik ... 69
1 Rekapitulasi perlakuan 1 jenis enzim komersial dengan pelarut
air dan atau etanol untuk ekstraksi ... 39 2 Rekapitulasi perlakuan 2 atau 3 jenis enzim komersial dengan
pelarut air dan etanol untuk ekstraksi ... 40 3 Data dasar buah vanili segar dan kering hasil pengeringan
1 Reaksi hidrolisis glukovanilin oleh enzim β-glukosidase………... 6
2 Ekspor dan impor komoditas vanili di Indonesia pada tahun 1999-2003 ... 10
3 Bentuk ekspor dan impor komoditas vanili di Indonesia pada tahun 1999-2003 ... 11
4 Luas areal perkebunan vanilli berdasarkan status pengusahaan di Indonesia pada tahun 1999-2003 ... 12
5 Produksi vanili kering berdasarkan status pengusahaan di Indonesia pada tahun 1999-2003 ... 13
6 Harga vanili segar di pasar dalam negeri pada tahun 1997-2001 .. 13
7 Bunga serta buah vanili mentah (a) dan buah vanili matang (b) .... 14
8 Buah vanili kering ……….………... 16
9 Struktur kimia vanilin ……..………... 17
10 Komposisi bagian dalam buah vanili dengan potongan melintang pembesaran 20 kali ... 19
11 Potongan melintang buah vanili hijau dengan pembesaran 400 kali ...………..………. 20
12 Transformasi glukovanilin dan vanilin ………... 22
13 Ekstraksi vanili dengan metode perkolasi ……….. 24
14 Struktur selulosa ………. 26
15 Skema tahapan dalam selulolisis …..………... 26
16 Struktur kimia pektin …..………... 29
17 Wilayah smooth homopolimer termetilasi pektin ………... 30
18 Wilayah non-gelling hairy pektin ………..……… 30
19 Model induced fit Koshland ………... 32
20 Buah Vanilla planifolia Andrews segar (a) dan kering (b)... 35
21 Diagram alir tahapan penelitian ………. 36
22 Vanili kering (a) dan segar (b) hasil pengeringan beku ... 47
23 Penentuan suhu inkubasi optimum enzim β-glukosidase ... 50
26 Ekstrak buah vanili segar dengan penambahan satu jenis enzim komersial dengan pelarut air dan atau etanol, dari kiri ke kanan: air, air+etanol, selulase+air selulase+air+etanol, pektinase+air, pektinase+air+etanol, β-glukosidase+air,
β-glukosidase+air+etanol ... 64 27 Kadar vanilin dan glukosa ekstrak buah vanili kering (kontrol)
dan vanili segar dengan penambahan 2 atau 3 jenis enzim
komersial dengan pelarut air+etanol ... 65 28 Padatan terlarut ekstrak vanili segar, dari kiri ke kanan: selulase+
pektinase, selulase+β-glukosidase, pektinase
+β-glukosidase, selulase+pektinase+β-glukosidase, β-glukosidase. 66 29 Ekstrak vanili segar dengan penambahan 2 atau 3 jenis enzim
komersial dengan pelarut air+etanol, dari kiri ke kanan: selulase+pektinase, selulase+β-glukosidase,
pektinase+β-glukosidase, selulase+pektinase+β-glukosidase ... 68 30 Penentuan konsentrasi optimum enzim β-glukosidase ... 69 30 Ekstrak vanili segar dengan konsentrasi enzim β-glukosidase
yang berbeda ... 71 32 Penentuan waktu inkubasi optimum enzim β-glukosidase ... 71 33 Ekstrak vanili segar dengan waktu inkubasi enzim β-glukosidase
yang berbeda ... 73
1 Data dasar buah vanili segar dan kering ... 83 2 Kurva standar vanilin dan glukosa ………. 83 3 Kadar vanilin ekstrak buah vanili segar dalam penentuan suhu
inkubasi optimum enzim β-glukosidase ……… 85 4 Kadar glukosa ekstrak buah vanili segar dalam penentuan suhu
inkubasi optimum enzim β-glukosidase ………. 86 5 Kadar vanilin ekstrak buah vanili kering dan segar dengan
penambahan 1 jenis enzim komersial ………. 88 6 Kadar glukosa ekstrak vanili kering dan segar dengan
penambahan 1 jenis enzim komersial ………. 90 7 Kadar vanilin ekstrak buah vanili segar dengan
penambahan 2 atau 3 jenis enzim komersial ……….. 93 8 Kadar glukosa ekstrak buah vanili segar dengan penambahan 2
atau 3 jenis enzim komersial ………... 94 9 Kadar vanilin ekstrak buah vanili segar dalam penentuan
konsentrasi optimum enzim β-glukosidase .……… 96 10 Kadar glukosa ekstrak buah vanili segar dalam penentuan
konsentrasi optimum enzim β-glukosidase ……… 98 11 Kadar vanilin ekstrak buah vanili segar dalam penentuan waktu
inkubasi optimum enzim β-glukosidase .……… 99 12 Kadar glukosa ekstrak buah vanili segar dalam penentuan waktu
PENDAHULUAN
LATAR BELAKANG
Vanili adalah tanaman tropis bernilai ekonomi tinggi karena merupakan rempah termahal kedua yang diperdagangkan di dunia internasional. Harga vanili segar rata-rata di pasar dalam negeri dari tahun 1999 sampai 2003 naik turun, dimana pada tahun 2003 harga vanili segar melonjak tajam mencapai Rp.301.330/kg. Sedangkan harga vanili kering pada tahun 2002 cukup tinggi berkisar Rp.2.000.000 hingga Rp.3.000.000/kg (Deptan 2004). Informasi harga terakhir (tahun 2006) yang diperoleh dari para petani di Kuningan dan Sumedang adalah Rp.65.000/kg untuk vanili segar dan Rp.700.000/kg untuk vanili kering.
Berdasarkan data Biro Pusat Statistik (BPS) yang diolah Deptan (2004), sejak tahun 2001 sampai 2003, areal terluas yang digunakan untuk tana man vanili terdapat di provinsi Sulawesi Utara, Sulawesi Selatan dan Nusa Tenggara Timur, dimana mayoritas berstatus Perkebunan Rakyat (PR). Produksi vanili kering yang mayoritas merupakan PR tersebut mengalami peningkatan, dari 1.791 ton pada tahun 1999 menjadi 1.680 ton tahun 2000, 2.196 ton tahun 2001 dan 2.730 ton tahun 2002.
Sementara itu, ekspor vanili kering dari tahun 1999 sampai tahun 2002 terus meningkat dan berdasarkan data sementara pada tahun 2003 melonjak tajam hingga mencapai 6.363 ton dengan nilai 19.275.000 US$. Meski demikian, nilai ekspor vanili turun naik sesuai dengan harga yang berlaku dipasaran, dipengaruhi oleh ketersediaan barang, besarnya permintaan serta mutu barang. Pada tahun 2003, tiga negara tujuan ekspor terbesar dalam bentuk kering utuh (whole bean) adalah Cina, Amerika Serikat dan Jerman. Sedangkan untuk ekspor olahan vanili kering (other vanilla) adalah Amerika Serikat, Korea dan Singapura.
kebutuhan dalam negeri dan sebagian lainnya diekspor kembali. Hingga saat ini, Indonesia belum mampu memproduksi bentuk olahan vanili kering secara maksimal sehingga permintaan dalam negeri terhadap produk-produk tersebut masih tergantung pada negara pengimpor seperti Korea, Amerika Serikat dan Papua New Giunea. Hal ini kemungkinan besar disebabkan vanili kering di Indonesia masih memiliki kualitas rendah dibanding potensi sebenarnya akibat pemanenan buah belum cukup tua serta proses kuring yang kurang sempurna. Diketahui bahwa vanili kering Indonesia memiliki flavor woody dan burn sehingga kualitas ekstrak vanili alami pun menjadi rendah (Zahorik, 2006).
Ekstrak vanili merupakan salah satu bentuk vanili olahan yang lebih mudah dan luas penggunaannya. Ekstrak vanili digunakan di seluruh dunia sebagai flavouring agent dessert, like baked goods, es krim, minuman dan custard. Selain itu ekstrak vanili digunakan oleh industri selain pangan seperti parfum, obat-obatan dan kosmetik (de Guzman dan Siemonsma 1999).
Pada level industri, ekstrak vanili alami diproses dengan metode konvensional (maserasi atau perkolasi) selama sekitar 1 bulan menggunakan buah yang telah melalui proses kuring karena buah vanili segar tidak memiliki aroma. Proses kuring dimulai 1 minggu setelah pane n yang terdiri dari killing, sweating (fermenting), drying dan conditioning. Seluruh proses ini memakan waktu kurang lebih 5 bulan hingga dihasilkan vanili kering (cured vanilla) (Deptan 2004). Proses fermentasi yang panjang merubah beberapa glukosida menjadi glukosa, vanilin dan kompleks flavor lainnya. Glukosida dengan jumlah tertinggi adalah glukovanilin yang menghasilkan vanilin oleh aktifitas enzim β-glukosidase.
Berdasarkan hal- hal yang disebutkan di atas, penelitian ini dilakukan sebagai upaya pengembangan metode ekstraksi secara enzimatik langsung dari buah vanili segar, untuk mereduksi biaya karena harga vanili segar dan biaya produksi lebih murah serta untuk mereduksi waktu karena glukovanilin dapat langsung diekstrak dari buah vanili segar dan secara bersamaan ditransformasi menjadi vanilin oleh kombinasi enzim yang berhubungan dengan degradasi dinding sel (selulase dan pektinase komersial) dan hidrolisis glukovanilin (β-glukosidase komersial). Selain itu, kadar vanilin yang dihasilkan pun bisa lebih tinggi dibanding ekstrak vanili kering akibat digunakannya β-glukosidase komersial serta metode persiapan sampel buah vanili segar dengan cara pengeringan beku dilanjutkan dengan penggilingan menyebabkan interaksi enzim dengan substrat lebih optimum.
PERUMUSAN MASALAH
enzimatik (menggunakan enzim-enzim hidrolitik komersial) terhadap buah vanili segar yang telah mengalami persiapan sampel dengan cara pengeringan beku dilanjutkan dengan penggilingan.
Masalah yang diteliti adalah pengaruh penggunaan enzim selulase, pektinase dan β-glukosidase komersial serta pelarut yakni air dan atau etanol, serta efek sinergisme ketiga enzim komersial tersebut terhadap kadar vanilin dan glukosa yang dihasilkan dalam ekstrak vanili dari buah vanili segar. Disamping itu, penentuan konsentrasi, waktu dan suhu inkubasi enzim yang diperlukan hingga kadar vanilin bebas dalam ekstrak mencapai batas optimum, merupakan tahapan-tahapan kritis yang harus diketahui dalam pengembangan metode ekstraksi enzimatik.
KERANGKA PEMIKIRAN
Pada level industri, ekstrak vanili alami umumnya diproses menggunakan buah vanili kering yang telah melalui proses kuring karena buah vanili segar tidak memiliki aroma. Proses kuring dapat dilakukan dengan beberapa cara, tapi pada prinsipnya metode kuring yang dilakukan di Indonesia tidak jauh berbeda dengan metode kuring klasik yang dilakukan di negara- negara lainnya seperti Madagaskar dan Meksiko. Tahap pertama adalah killing dengan mencelupkan vanili segar ke dalam air panas 650C selama 2-3 menit. Setelah itu dilakukan pemeraman (sweating atau fermenting) selama 48 jam agar terjadi reaksi enzimatik dalam buah untuk pembentukan aroma, dimana pada tahap ini β-glukosidase mengubah glukovanilin menjadi vanilin dan glukosa. Tempat fermentasi terbuat dari peti kayu yang dilapisi serbuk gergaji atau styrofoam untuk mempertahankan suhu 38-400C. Tahap selanjutnya adalah pengeringan (drying) dengan sinar matahari selama 10-20 hari dari jam 8.00-10.00, lalu dibungkus kain hitam dan dijemur kembali jam 14.00-15.00 dan dibungkus lagi pada malam harinya. Setelah itu dilakukan pengeringan lambat dengan suhu 28-290C dan kelembaban 80% selama 30-35 hari. Tahap terakhir adalah pemantapan aroma (conditioning) dengan menyimpan vanili di dalam kotak kering selama 2-3 bulan (Deptan 2004).
melalui reaksi enzimatik. Goris (1947), diacu dalam Purseglove et al. (1981), menemukan bahwa vanili segar mengandung paling sedikit 4 glukosida yang menghasilkan vanilin dan komponen flavor lainnya. Glukosida dengan jumlah tertinggi adalah glukovanilin. Selanjutnya glukovanililalkohol ditemukan dalam jumlah yang lebih sedikit, diikuti oleh glukosida dari asam protokatekuat (asam 3,4-dihidroksi benzoat).
hidrolisis
H
CHO
cincin H O-CH3 vanilin glukosa
Gambar 1 Reaksi hidrolisis glukovanilin oleh enzim β-glukosidase
Metode ekstraksi menggunakan buah vanili kering telah banyak dikembangkan. Dua metode yang paling banyak digunakan adalah metode maserasi dan perkolasi. Cowley (1973), menggunakan metode perkolasi menggunakan buah vanili kering yang diawali dengan pemotongan buah vanili dan pencampuran gula untuk meningkatkan viskositas, membantu memperkuat dan menahan senyawa aromatik, meningkatkan warna serta memperpanjang umur simpan. Selanjutnya dilakukan perkolasi (sirkulasi) menggunakan campuran etanol dan air selama 3 sampai 4 minggu. Kemudian dilakukan aging, sentrifugasi dan filtrasi hingga diperoleh ekstrak vanili. Metode yang lebih modern adalah maserasi yakni dengan menempatkan buah vanili kering dalam maserator yang dilengkapi pengaduk selama 1 sampai 3 bulan dengan penambahan etanol 60% (Purseglove et al. 1981).
metode perkolasi, vanili segar yang telah dipotong diletakkan diatas alas berlubang, kemudian direndam dengan alkohol 60%, dimana larutan alkohol tersebut disirkulasi dan suhu dipertahankan 38-490C. Proses ekstraksi ini berlangsung selama 2 minggu, lalu dilakukan aging selama 3-6 bulan.
Perkembangan selanjutnya dalam ekstraksi vanili segar adalah dengan menambahkan enzim komersial. Sreenath et al. (1994), menunjukkan bahwa penambahan enzim selulase, pektinase atau kombinasi keduanya menghasilkan nilai perolehan kembali (recovery) 81-86%. Nilai perolehan kembali ini lebih tinggi dibanding sampel yang tidak mengalami perlakuan enzim yakni sebesar 72%. Penemuan mengenai ekstraksi vanili segar menggunakan enzim kemudian dipatenkan oleh Brunerie (1998) (U.S. patent 5705205). Hasil penelitiannya menunjukkan bahwa penggunaan enzim pektinase dan hemiselulase dalam ekstraksi vanili segar diikuti penambahan etanol 50%v/v mampu menghasilkan kadar vanilin lebih tinggi dibanding ekstraksi tanpa penambahan enzim. Selanjutnya Ruiz- Teran et al. (2001), melaporkan bahwa ekstraksi vanili segar dalam 2 tahap reaksi enzimatik menggunakan Viscozyme lalu Celluclast yang mengandung aktifitas pektinase dan selulase, diikuti penambahan etanol 47,5%v/v menghasilkan kadar vanilin ekstrak 3.13 kali lebih tinggi dibanding ekstrak vanili kering metode Soxhlet. Selain itu, Waliszewski et al. (2003), merekomendasikan penelitiannya yang menggunakan enzim komersial CrystalzymePML-MX (Valley Reserarch Inc), Novozym 342 (Novo Nordisk) dan Zymafilt L-300 (Enmex) dengan aktifitas selulosik tinggi di dalam etanol konsentrasi 5-12%, diikuti dengan ekstraksi vanilin dengan etanol 60%v/v. Hasilnya menunjukkan bahwa konsentrasi vanilin ekstrak buah vanili segar dengan Novozym, Crystalzyme dan Zymafilt adalah lebih tinggi dibanding ekstraksi tanpa penambahan enzim.
yang mampu mendegradasi dinding sel serta β-glukosidase komersial yang dapat menghidrolisis glukovanilin. Disamping itu, dilakukan metode persiapan sampel buah vanili segar dengan cara pengeringan beku dilanjutkan dengan penggilingan sehingga luas permukaan bahan lebih besar yang menyebabkan interaksi enzim dengan substrat lebih optimum. Hal ini berbeda dengan penelitian ekstraksi enzimatik buah vanili segar lainnya, yang pada umumnya menggunakan buah vanili segar utuh dengan suhu penyimpanan 40C sebelum percobaan dilakukan.
TUJUAN PENELITIAN Tujuan Umum
Tujuan penelitian ini secara umum adalah untuk mendapatkan metode ekstraksi vanili secara enzimatik dari buah vanili segar.
Tujuan Khusus
Tujuan yang lebih khusus dari penelitian ini antara lain: 1. Mengetahui karakteristik kimia buah vanili segar dan kering. 2. Menentukan suhu inkubasi optimum enzim β-glukosidase.
3. Menentukan pengaruh penggunaan enzim selulase, pektinase dan β -glukosidase komersial secara tunggal maupun kombinasi serta penggunaan pelarut air dan atau etanol terhadap kadar vanilin dan glukosa dalam ekstrak vanili dari buah vanili segar.
4. Menentukan konsentrasi optimum enzim terpilih yang terbaik. 5. Menentukan waktu inkubasi optimum enzim terpilih yang terbaik. 6. Mengetahui karakteristik kimia ekstrak vanili segar.
HIPOTESIS
MANFAAT PENELITIAN
Penelitian ini diharapkan dapat berguna bagi:
1. Industri flavor agar mendapatkan ekstrak vanili alami dengan kadar vanilin tinggi dan waktu ekstraksi yang singkat.
TINJAUAN PUSTAKA
TINJAUAN STATISTIK KOMODITAS VANILI DI INDONESIA
Salah satu komoditas hasil perkebunan yang mempunyai nilai ekonomi relatif tinggi adalah buah vanili. Trend ekspor dan impor vanili di Indonesia dari tahun 1999 sampai dengan 2003 dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2 Ekspor dan impor komoditas vanili di Indonesia pada tahun 1999-2003 ( BPS, diolah Deptan 2004)
Bentuk komoditas vanili yang diekspor dan diimpor dapat dikelompokkan menjadi 2 yakni whole bean dan other vanilla. Bentuk whole bean merupakan bentuk vanili utuh kering yang telah menga lami proses kuring. Sedangkan other vanilla merupakan bentuk olahan vanili lainnya setelah dilakukan proses kuring, yakni berupa ekstrak vanili, oleoresin, bubuk dan lain- lain. Adapun bentuk komoditas vanili yang diekspor dan impor dapat dilihat pada Gambar 3.
Berdasarkan data Biro Pusat Statistik (BPS) yang diolah Deptan (2004), 3 negara tujuan ekspor Indonesia terbesar pada tahun 2002 untuk bentuk vanili utuh kering antara lain Amerika Serikat 241.786 ton, Jerman 51.315 ton dan Hongkong 9.356 ton. Posisi ini berubah pada tahun 2003 dimana peringkat pertama digantikan oleh Cina sebesar 6.000.000 ton, disusul Amerika Serikat 190.010 ton dan Jerman 25.028 ton. Untuk ekspor olahan vanili, 3 negara tujuan ekspor Indonesia terbesar pada tahun 2002 antara lain Cina sebesar 3.000.000 ton, Malaysia 216.919 ton dan Amerika Serikat 36.539 ton. Posisi ini berubah pada
468
1999 2000 2001 2002 2003 tahun
volume (ton)
1999 2000 2001 2002 2003
tahun
volume (ton)
tahun 2003 dimana urutan pertama digantikan oleh Amerika Serikat 63.971 ton, disusul Korea 26.030 ton dan Singapura 19.815 ton. Sedangkan data dari Cina sendiri yang tahun sebelumnya menempati peringkat pertama sebagai negara tujuan ekspor bentuk olahan vanili Indonesia, masih belum tercantum.
Gambar 3 Bentuk ekspor dan impor komoditas vanili di Indonesia pada tahun 1999-2003(BPS, diolah Deptan 2004)
Negara pengimpor terbesar pada tahun 2002 berdasarkan data Biro Pusat Statistik (BPS) yang diolah Deptan (2004), untuk bentuk vanili utuh kering adalah Papua New Giunea 1.476.789 ton. Pada tahun 2003, 3 negara pengimpor terbesar adalah Papua New Giunea sebesar 53.418 ton, Amerika Serikat 8.121 ton dan Singapura 1.050 ton. Sedangkan untuk impor olahan vanili, 3 negara pengimpor terbesar pada tahun 2002 antara lain Timor Timur 14.804 ton, Australia 10.457 ton dan Malaysia 8.277 ton. Posisi ini berubah pada tahun 2003 dimana posisi pertama digantikan oleh Korea 33.025 ton, disusul Amerika Serikat 16.814 ton dan Papua New Giunea 1.148 ton. Sedangkan data dari Timor Timur sendiri yang tahun sebelumnya menempati urutan pertama sebagai negara pengimpor, masih belum tercantum.
Negara terbesar yang memproduksi dan mengekspor vanili, dimana memenuhi kebutuhan pasar dunia adalah Indonesia (682 ton, 40%), Madagaskar
1999 2000 2001 2002 2003
tahun
luas (Ha)
(673 ton, 40%), Comoros (211 ton, 12%), dan Tonga (38 ton, 2%). Negara Asia Tenggara lainnya yang mengekspor sejumlah kecil vanili adalah Malaysia, Filipina, Thailand dan Singapura (de Guzman dan Siemonsma 1999). Adapun profil luas area perkebunan vanilli berdasarkan status pengusahaan di Indonesia dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4 Luas areal perkebunan vanilli berdasarkan status pengusahaan di Indonesia pada tahun 1999-2003 (BPS, diolah Deptan 2004)
Berdasarkan data Biro Pusat Statistik (BPS) yang diolah Deptan (2004), luas areal tanaman vanili yang mayoritas Perkebunan Rakyat (PR) tersebut, tersebar di berbagai provinsi di Indonesia. Sejak tahun 2001 sampai 2003 areal terluas yang digunakan untuk tanaman vanilli terdapat di Prov. Sulawesi Utara dengan rata-rata 5877 ha, Sulawesi Selatan 2742 ha dan Nusa Tenggara Timur 2175 ha. Di provinsi lainnya pun terdapat perkebunan vanilli milik rakyat, tapi dengan luas yang lebih rendah, kecuali untuk Provinsi Nanggroe Aceh Darussalam, Riau, Bangka Belitung, DKI Jakarta, Kalimantan Barat, Kalimantan Tengah, Sulawesi Tenggara dan Irian Jaya yang sama sekali tidak memiliki perkebunan vanili dengan status PR, Perkebunan Negara (PN) maupun Perkebunan Swasta (PS). Adapun profil produksi vanilli kering berdasarkan status pengusahaan dapat dilihat pada Gambar 5.
1999 2000 2001 2002 2003
tahun
1997 1998 1999 2000 2001
tahun
harga (000 Rp/kg)
Gambar 5 Produksi vanili kering berdasarkan status pengusahaan di Indonesia pada tahun 1999-2003 (BPS, diolah Deptan 2004)
Seperti halnya harga vanili kering, harga vanili segar pun naik turun. Profil harga vanili segar rata-rata di pasar dalam negeri dapat dilihat pada Gambar 6 (BPS, diolah Deptan 2004). Harga tahun 2000 dan 2001 yang terlihat pada Gambar 6 adalah data daerah Provinsi Jawa Tengah. Pada awal tahun 2005 ini, menurut informasi yang diperoleh dari para petani di Kabupaten Kuningan, Jawa Barat, harga vanilli segar berkisar Rp.65.000/kg dan vanili kering Rp.700.000/kg.
Gambar 6 Harga vanili segar di pasar dalam negeri pada tahun 1997-2001 (BPS, diolah Deptan 2004)
BOTANI, STRUKTUR DAN SENYAWA KIMIAWI PENYUSUN BUAH VANILI
Secara sistematik, vanili termasuk bunga monokotil famili Orchidaceae yang merupakan famili tumbuhan bunga terbesar dengan 700 genus dan 20.000 spesies. Untuk tujuan komersial, terdapat 3 spesies yang mempunyai nilai ekonomi tinggi yakni Vanilla planifolia Andrews, Vanilla pompana Schieda dan Vanilla tahitensis JW Moore. Jenis vanili yang paling banyak ditemui di Indonesia adalah Vanilla fragrans (Salibs.) Ames (syn. V. planifolia Andrews) yang sangat terkenal bermutu tinggi dan menduduki peringkat 1 dunia karena kadar vanilinnya yang tinggi (Deptan 2004). Buah vanili jenis V. planifolia Andrews dapat dilihat pada Gambar 7 (http://www.uyseg.org/greener_industry/ pages/vanilin/1Vanilin_AP.htm 2005; http:// www.ipa.gov.pg.com 2005).
(a) (b)
Gambar 7 Bunga serta buah vanili mentah (a) dan buah vanili matang (b)
Vanili dapat tumbuh dengan baik di iklim tropis dengan curah hujan 1000-3000 mm/tahun, suhu 200C serta kelembaban 60-80%. Tanaman vanili merupakan tanaman hutan dan hidup di bawah naungan pohon-pohon rindang. Tanaman ini tumbuh melekat pada pohon dengan sulur panjatnya, hingga mencapai tinggi berpuluh-puluh meter (http://www.kpel.or.id/TTGP/komoditi/PANILI1 2005)
hanya dapat terjadi di Meksiko, Guatemala dan bagian lain dari Amerika Tengah, yakni dengan lebah genus Melapona, disamping burung kolibri yang juga diperkirakan sebagai agen penyerbukan. Metode penyerbukan menggunakan tangan ditemukan pertama kali oleh Morren di Liege tahun 1836 dan Edmond Albius yang menemukan metode praktis penyerbukan buatan pada tahun 1841, dimana metode ini masih digunakan sampai sekarang (Purseglove et al. 1981).
Tanaman vanili akan berbunga setelah 2 tahun, mulai berbuah setelah 3 tahun dan mencapai hasil maksimum dalam waktu 10-12 tahun. Vanili berbunga satu kali dalam setahun dan hanya 50 bunga dari setiap tanaman yang dapat dilakukan penyerbukan menggunakan tangan (Heath dan Reineccius 1986). Setelah pembuahan berhasil, buah membutuhkan waktu 6 bulan untuk mencapai ukuran yang maksimal (6-10 inci) dan 8-9 bulan untuk matang. Masa panen vanili di Indonesia berlangsung sekitar 2-3 bulan antara Mei sampai dengan Juli (http://www.kpel.or.id/TTGP/komoditi/PANILI1 2005).
Buah vanili berbentuk silinder dengan panjang 10-25 cm dan diameter 5-15 mm (Purseglove et al. 1981). Secara prinsip terdapat 2 bagian dalam buah vanili yakni dinding buah atau daerah hijau yang meliputi epidermis, ground dan jaringan vaskular dari dinding buah. Kedua adalah bagian putih yang terdiri dari 3 plasenta parietal (tidak termasuk biji) dan 3 pita dari glandular rambut yang berperan penting dalam biosintesis vanilin. Daerah hijau terdapat sekitar 60% dan daerah putih serta biji masing- masing sekitar 20% dari berat buah.
Epidermis mengandung sel-sel epidermal dengan diameter yang sama. Setiap sel epidermal mengandung suatu kristal romboidal dari kalsium oksalat dan terikat rapat di dinding sel. Dinding buah me ngandung suatu cincin yang terdiri dari 15 bundel vaskular yang tidak bercabang, dimana masing- masing mengandung satu untai silem terdiri dari elemen-elemen anular sampai helikal serta retikulatdan floem dengan satu sclerotic bundle sheath.
buah bagian luar, jaringan dinding di samping cincin dari bundel vaskular mengandung sel-sel lebih besar, tapi sedikit mengandung kloroplas sehingga tidak begitu hijau.
Perkembangan buah menyebabkan rambut inter plasenta membentuk dinding yang lunak dan suatu sitoplasma yang kompleks. Akibat ukuran, jumlah dan lunaknya dinding, rambut dengan mudah dapat dilihat dalam potongan melintang buah vanili sebagai 3 lustrous white band. Beberapa biji dapat tertekan masuk ke dalam rambut dalam buah matang. Dimana sel-sel rambut tersebut mengandung sejumlah besar lemak, yang dilepaskan ke dalam lokul dan menyelimuti biji jika kemudian rambut tersebut matang dalam buah masak (Havkin-Frenkel et al. 2004). Struktur buah vanili segar sebagaimana telah dijelaskan di atas, akan berubah jika buah mengalami proses kuring (Gambar 8) (http://wwwchem.uwimona.edu.jm:1104/lectures/vanilla.html 2005).
Gambar 8 Buah vanili kering
Vanilin merupakan komponen aroma utama yang terdapat dalam buah vanili yakni sebesar 85% dari total senyawa volatil. Komponen lainnya adalah p-hidroksi benzaldehid (sampai 9%) dan p-hidroksi benzil metil eter (1%). Disamping itu, khusus untuk vanili Tahiti memiliki flavor berbeda akibat adanya komponen tambahan yakni piperonal (heliotropin, 3,4-dioksimetilen benzaldehid) dan diasetil (butandion) (http://www.portal.remarkablefoods.com 2005).
kering Vanilla planifolia Andrews, mengandung 20 g air, 3-5 g protein, 11 g lemak, 7-9 g gula, 15-20 g serat, 5-10 g abu, 1.5-3 g vanilin, 2 g soft resin dan asam vanilat yang tidak berflavor.
PREKURSOR DAN ENZIM PEMBENTUK VANILIN DI DALAM BUAH VANILI
Flavor dan aroma unik vanili berasal dari senyawa fenolik vanilin (98% dari total komponen flavor vanili) serta dari senyawa lainnya. Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) dengan rumus kimia C8H8O3 dan berat molekul 152.14 merupakan komponen utama senyawa aromatik volatil dari buah vanili (http://wwwchem.uwimona.edu.jm:1104/lectures/vanilla.html 2005). Struktur kimia senyawa vanilin dapat dilihat pada Gambar 9 (http://www.uyseg.org/greener_industry/ pages/vanilin/1Vanilin_AP.htm 2005).
Gambar 9 Struktur kimia vanilin
Setelah penyerbukan, sejumlah besar serbuk sari mendekati putik. Tabung serbuk sari terdapat dalam 3 kelompok, dimana masing- masing berlokasi dalam suatu kantung pada salah satu sisi dari setiap 3 plasenta, diapit oleh rambut. Biasanya glandular rambut mulai berkembang cepat dalam wilayah antara plasenta. Masing- masing rambut tidak bercabang dan kemudian mencapai panjang sekitar 300 mikrometer (Gambar 10). Rambut menjadi terikat bersama-sama selama masa pengembangan dan kemudian rusak lalu melepaskan kandungannya ke dalam lokul. Rambut yang berkembang memiliki banyak retikulum endoplasma, struktur ribosom dan plastida yang mengandung globula lemak dan komponen lainnya yang menandai adanya sel-sel aktif secara metabolik. Swamy (1947) diacu dalam Odoux et al. (2003), menunjukkan bahwa vanilin dihasilkan dalam glandular rambut. Pendapat ini dikonfirmasi oleh Havkin-Frenkel et al. (2004), yang membuktikan bahwa vanilin dan intermediet yang berhubungan dalam biosintesis vanilin terakumulasi dalam jaringan putih bagian dalam (pada buah matang), di sekeliling rambut plasenta. Dengan kata la in selama pengembangan buah yakni sekitar 8-10 bulan, prekursor flavor terakumulasi dalam jaringan plasenta disekeliling biji. Ditemukan juga bahwa jaringan plasenta mengandung intermediet dari biosintesis vanilin yang meliputi asam 4-kumarat, 4-hidroksi benzaldehid dan 3,4-di4-hidroksi benzaldehid.
plasenta serta biji hanya mengandung 20-40% dari total glukovanilin. Pada Gambar 10 ditunjukkan jaringan plasenta yang mengelilingi biji (berwarna hitam) dan sel rambut yang merupakan daerah hijau.
korteks sel rambut biji
jaringan plasenta
Gambar 10 Komposisi bagian dalam buah vanili dengan potongan melintang pembesaran 20 kali (Havkin-Frenkel et al. 2004)
Mengenai lokasi utama enzim β-glukosidase dalam buah vanili, Havkin-Frenkel et al. (2004), berpendapat bahwa enzim-enzim hidrolitik (β-glukosidase) atau enzim degradatif lainnya yang mengkatalisis pelepasan komponen flavor dari prekursor flavor, berlokasi paling banyak dalam daerah dinding buah bagian luar. Diperkirakan bahwa aktifitas β-glukosidase beberapa kali lebih tinggi dalam dinding buah bagian luar dari pada dalam jaringan plasenta dan glandular sel rambut. Sedangkan Arana (1943) diacu dalam Odoux et al. (2003), menyatakan bahwa β-glukosidase terdapat dalam dinding buah bagian luar, sedangkan jaringan plasenta sama sekali tidak mengandung aktifitas β-glukosidase. Mengenai vanilin yang dilepaskan selama proses kuring, ia menyimpulkan bahwa glukovanilin berdifusi dalam air dari bagian pusat ke permukaan buah sehingga terjadi hidrolisis.
globular lemak
rambut inter sel parenkim
plasenta
Gambar 11 Potongan melintang buah vanili hijau dengan pembesaran 400 kali (Havkin-Frenkel et al. 2004)
Akan tetapi, pendapat Havkin-Frenkel et al. (2004) dan Arana (1943) diacu dalam Odoux et al. (2003) tersebut, disanggah oleh Odoux et al. (2003), yang menunjukan bahwa distribusi jaringan dari aktifitas β-glukosidase sama dengan glukovanilin, meskipun sejumlah kecil aktifitas β-glukosidase terdeteksi dalam bagian luar yang berdaging, dimana glukovanilin tidak terdeteksi. Enzim ini terutama berlokasi dalam lamina plasenta dan dengan jumlah yang lebih sedikit terdapat dalam papila. Disamping itu ditemukan pula bahwa antara enzim dan substrat terdapat dalam jaringan yang sama, meskipun mungkin terdapat dalam 2 bagian berbeda di dalam sel (sitoplasma dan atau periplasma untuk β-glukosidase dan vakuola untuk glukovanilin). Hal inilah yang menyebabkan mengapa vanilin tidak dilepaskan hingga buah matang atau saat kuring. Hidrolisis glukovanilin yang terjadi pada tahap pematangan lambat ketika buah menjadi hitam dan pada tahap awal kuring, dapat disebabkan perubahan tonoplas sehingga membran sitoplasma dan dinding sel bersatu.
kenyataan bahwa kristalisasi vanilin lebih banyak terjadi pada bagian blossom-end matang dibanding pada stem-end (Purseglove et al. 1981).
Begitu pula dengan kandungan dan aktifitas β-glukosidase yang meningkat dengan meningkatnya kematangan buah (seiring dengan terbentuknya glukovanilin). Pada saat buah hijau, aktifitas β-glukosidase dan kandungan vanilin bebas dapat diabaikan. Aktifitas maksimum β-glukosidase terjadi saat fase split blossom-end yellow dan kandungan vanilin bebas paling tinggi terdapat pada tahap yang mengakibatkan warna buah menjadi coklat. Aktifitas β-glukosidase sebagian tidak aktif jika buah menjadi coklat (chocolate brown) pada setengah panjangnya, tapi dapat diaktifkan kembali selama kuring (Purseglove et al. 1981).
REAKSI ENZIMATIK SELAMA PROSES KURING
Selanjutnya dilakukan conditioning selama beberapa bulan yang bertujuan agar dihasilkan vanili kering dengan flavor optimum. Seluruh proses kuring ini memakan waktu sekitar 3 sampai 6 bulan atau lebih lama lagi tergantung metode kuring yang digunakan (Havkin-Frenkel et al. 2004).
Pada tahap awal proses kuring terjadi degradasi dinding sel buah secara enzimatik oleh enzim-enzim tertentu seperti selulase, pektinase, hemiselulase dan lain- lain. Setelah itu diikuti oleh transformasi prekursor flavor oleh enzim β -glukosidase yang termasuk tipe ketiga dari enzim selulase. Mekanisme transformasi glukovanilin menjadi vanilin dapat dilihat pada Gambar 12.
β-glukosidase
glukovanilin glukosa + vanilin
peroksidase polifenol oksidase
pigmen stabil asam vanilat
(kuinon) transformasi nonenzimatik
aroma khas vanilin
Gambar 12 Transformasi glukovanilin dan vanilin (Purseglove et al. 1981)
Penelitian-penelitian telah banyak dilakukan untuk mengidentifikasi komponen kimia yang membentuk flavor vanili kering, tapi sangat sedikit penelitian yang mempublikasikan bagaimana komponen-komponen tersebut terbentuk selama proses kuring. Proses panas, reaksi enzim dan aktifitas mikroba adalah yang digambarkan penting dalam pembentukan flavor (Roling et al. 2001).
EKSTRAKSI BUAH VANILI Ekstraksi Vanili Konvensional
pencampuran buah vanili dengan pelarut polar seperti etanol dan air. Like dissolves like adalah acuan untuk memilih jenis pelarut yang digunakan (Tesla 2000; http://www.ktf-split.hr/glossary/en_o.php?def=extraction 2005).
Air merupakan molekul polar yang memiliki ujung muatan negatif dan positif sehingga molekul air dapat berinteraksi satu dengan yang lainnya. Molekul air juga dapat berinteraksi dengan molekul polar lainnya. Polaritas dari suatu ikatan adalah distribusi muatan listrik atom yang digabungkan melalui ikatan. Muatan listrik pada beberapa atom yang tidak sama disebut muatan parsial dan keberadaan muatan parsial tersebut adalah terdapat dalam suatu ikatan polar. Sedangkan molekul non polar adalah molekul yang mengandung distribusi yang simetris dari muatan lisrik (Tesla 2000).
Jenis pelarut lainnya yang biasa digunakan dalam ekstraksi vanili adalah etanol. Etanol (CH3CH2OH) merupakan suatu alkohol yang mengandung gugus hidroksil (-OH) yang terikat pada atom karbon. Titik didih etanol adalah 78.50C dan memiliki berat jenis 0.789 g/ml pada 200C. Etanol bersifat polar yang dapat dicampur dengan air dan pelarut organik lainnya (http://www. scifun.chem.wisc.edu/chemweek/ethanol/ethanol.html 2005). Pelarut etanol cair yang digunakan dalam pembuatan ekstrak vanili mampu mengekstrak senyawa aromatik yang terdapat dalam buah vanili. Kandungan alkohol minimum adalah 35%v/v dan kandungan buah vanili adalah 1 bagian (berat) dalam 10 bagian (volume) dari ekstrak. Di Australia kandungan alkoho l dari ekstrak vanili bervariasi antara 50-57% (Cowley 1973).
Disisi lain, beberapa industri besar yang memproduksi ekstrak vanili mengacu pada Food and Drug Administration (FDA) yang mengatur bahwa ekstrak vanili alami harus mengandung alkohol minimum 35%, bahan terlarut dari 13.5 ons per galon (dengan kandungan air buah tidak lebih dari 25%) serta mengandung bahan lainnya seperti air, gliserin, propilen glikol, gula, dekstrosa atau sirup jagung. Spesifikasi ini menghasilkan konsentrasi single fold dan ekstrak biasanya dibuat pada konsentrasi two (26.7 ons per galon) atau four fold (http://www.uyseg.org/greener_industry/ pages/vanilin/1Vanilin_AP.htm 2005).
merendam buah vanili dalam larutan alkohol dan air. Campuran tersebut biasanya disimpan selama beberapa bulan untuk menghasilkan cairan coklat jernih dengan flavor vanili yang kuat. Pemanasan campuran dapat mempercepat proses, tapi hal ini dapat menyebabkan beberapa komponen flavor yang bersifat volatil menjadi hilang. Beberapa industri merekomendasikan proses ekstraksi dingin yang lebih lambat menggunakan resirkulasi pelarut (perkolasi) diatas buah untuk meminimalkan kehilangan komponen volatil. Salah satu metode perkolasi yang digunakan untuk ekstraksi vanili dapat dilihat pada Gambar 13 (http://www.uyseg.org/greener_industry/ pages/vanilin/1Vanilin_AP.htm 2005).
irisan buah vanili
pompa sirkulasi
suhu 38-490C alkohol 60%
Gambar 13 Ekstraksi vanili dengan metode perkolasi
Ekstraksi Vanili Secara Enzimatik
Meningkatnya permintaan terhadap produk-produk alami menyebabkan proses alternatif terus dikembangkan. Pengertian alami yang digunakan di Eropa dan Amerika Serikat adalah jika produk tersebut dihasilkan dari suatu bahan baku alami melalui proses biologis (misalnya enzim atau whole cells) atau proses mild (misalnya ekstraksi dan destilasi). Pada tahun-tahun terakhir, mulai dilakukan penelitian-penelitian mengenai biosintesis ekstrak vanili murni dan vanilin alami menggunakan mikroorganisme atau isolat enzim.
polisakarida, protein serta lignin) dan kemudian terjadi transformasi prekursor vanilin menjadi vanilin oleh enzim hidrolitik. Biopolimer tersebut bergabung bersama-sama dengan sejumlah kecil komponen lainnya seperti kelompok asetil dan senyawa fenolik. Adapun polisakarida utama penyusun dinding sel buah antara lain selulosa, hemiselulosa dan pektin (Aman dan Westerlund 1996).
Selulosa merupakan polisakarida linier dari residu glukosa, yang dihubungkan oleh ikatan β-1,4. Selulosa terdiri dari daerah kristalin dan daerah amorf (non-kristalin) yang membentuk suatu struktur dengan kekuatan tegangan tinggi, yang pada umumnya tahan terhadap hidrolisis enzimatik terutama pada daerah kristalin. Selulosa dapat dihidrolisis oleh kelompok enzim selulase yang terdiri dari suatu kompleks campuran dari enzim dengan spesifisitas berbeda dalam menghidrolisis ikatan glikosidiknya (Howard et al. 2003).
Enzim selulase terdiri dari 3 komponen besar yakni endoglukanase atau endo-1,4-β-glukanase (EC 3.2.1.4)/Cx, ekso-1,4-β-glukanase atau selobiohidrolase (EC 3.2.1.91)/C1 serta β-glukosidase atau selobiase (EC 3.2.1.21). Endoglukanase yang sering disebut karboksimetilselulosa (CM)-selulase, berperan dalam memulai serangan acak pada sisi internal daerah amorf dari serat selulosa sehingga sisi yang terbuka dapat diserang oleh selobiohidrolase. Enzim ini dapat memutuskan ikatan selulosa secara random menghasilkan glukosa dan selooligosakarida. Sedangkan ekso-1,4-β-glukanase atau selobiohidrolase menyerang bagian luar non-reducing end (Gambar 14) dari selulosa dengan selobiosa sebagai struktur utamanya (http://www.fibersource.com/f-tutor/selulosa.htm 2005). Ekso-1,4-β-glukanase adalah komponen utama dari sistem selulase fungi yakni sekitar 40-70% dari total protein selulase dan mampu menghidrolisis daerah kristalin. Ekso-1,4-β-glukanase memisahkan mono- dan dimer dari ujung rantai glukosa (Pilnik dan Voragen 1991; Howard et al. 2003).
non-reducing end reducing end
Gambar 14 Struktur selulosa
daerah kristalin daerah amorf
A. ENDO β-GLUKANASE, Cx, CMCase
B. EKSO β-GLUKANASE, C1, Avicelase
C. Cx / C1
D. β-GLUKOSIDASE
GLUKOSA
Beberapa mikroorganisme yang menghasilkan selulase antara lain fungi (Aspergillus niger, A. fumigatus, A. aculeatus, Acremonium cellulolyticus, Fusarium solani, Irpex lacteus, Penicillium funmiculosum, Phanerochaete, Chrysosporium, Schizophyllum commune, Sclerotium rolfsii, Sporotrichum cellulophillum, Talaromyces emersonii, Thielavia terrestris, Trichoderma koningii, T. reesii dan T. viride). Selain itu bakteri Clostridium thermocellum, Ruminococcus albus, Streptomyces sp. serta Actinomycetes seperti Streptomyces sp. dan Thermomonospora curvata dapat juga memproduksi enzim selulase.
Meskipun sejumlah besar mikroorganisme dapat mendegradasi selulosa, tapi hanya sedikit yang memproduksi enzim yang dapat secara sempurna menghidrolisis selulosa kristalin in vitro. Fungi adalah mikroorganisme utama yang memproduksi selulase. Genus Trichoderma dan Aspergillus menghasilkan selulase dan enzim kasar yang dihasilkan oleh mikroorganisme tersebut diproduksi secara komersial. Mikroorganisme dari genus Trichoderma menghasilkan sejumlah besar endo-β-glukanase dan ekso-β-glukanase, tapi hanya sedikit menghasilkan β-glukosidase. Sedangkan Aspergillus memproduksi
endo-β-glukanase dan β-glukosidase dalam jumlah besar, tapi sedikit menghasilkan ekso-β-glukanase (http://www.fao.org/docrep/w7241e/w7241e08.htm 2005). Pada umumnya enzim komersial selulase dari T. viride mengandung beberapa aktifitas enzim yang mampu mendegradasi dinding sel. Enzim kasar tersebut meliputi selulase, pektinase, hemiselulase dan lain- lain (http://www. serva.de/products/knowledge/061097.shtml 2005).
galakturonat. Sedangkan komponen yang jumlahnya lebih sedikit antara lain L-ramnosa, L- fukosa dan berbagai gula O-metil (Howard et al. 2003).
Hemiselulase seperti enzim-enzim lainnya yang menghidrolisis polisakarida dinding sel tanaman, merupakan protein multidomain. Protein tersebut pada umumnya mengandung modul katalitik dan non katalitik yang berbeda secara struktur. Modul non katalitik paling penting terdiri dari daerah yang mengikat karbohidrat, dimana memfasilitasi penargetan enzim pada polisakarida, pengikat interdomain dan modul dokerin yang menghubungkan pengikatan daerah katalitik melalui interaksi kohesi dokerin pada permukaan sel mikroba atau pada kompleks enzimatik seperti selulosom (Howard et al. 2003).
Senyawa silan merupakan hemiselulosa paling banyak dan silanase adalah salah satu hemiselulase terbesar yang menghidrolisis ikatan β-1,4 dalam rantai silan menghasilkan silooligomer pendek dimana lebih jauh dapat dihidrolisis menjadi unit silosa tunggal oleh β-silosidase. Silanase lainnya adalah α -D-glukuronidase yang menghidrolisis ikatan α-1,2-glikosidik dari asam 4-O-metil-D-glukuronik rantai samping silan. Hemiselulolitik esterase meliputi asetil esterase yang menghidrolisis substitusi asetil pada silosa dan feruloil esterase yang menghidrolisis ikatan ester antara substitusi arabinosa dan asam ferulik. Feruloil esterase dapat melepaskan hemiselulosa dari lignin dan membuat produk polisakarida bebas lebih mudah didegradasi oleh hemiselulase lainnya (Howard et al. 2003). Makro molekul hemiselulosa merupakan suatu polimer dari pentose (silosa dan arabinosa), heksosa (paling banyak manosa) dan sejumlah asam-asam gula. Sedangkan selulosa merupakan polimer homogen dari glukosa yang lebih tahan dibanding hemiselulosa karena struktur kristalinnya tinggi (Howard et al. 2003).
dan Rombouts 1981; http://www.saps.plantsci.cam.ac.uk/osmoweb/pektina se.htm 2005).
Semua tumbuhan hijau mengandung pektin yang bersama selulosa dapat mempengaruhi sifat struktural buah dan sayuran. Pektin terdiri dari unit-unit asam galakturonat dan asam galakturonatmetil ester yang membentuk rantai polisakarida linear dan secara normal diklasifikasikan berdasarkan derajat esterifikasinya. Pektin termasuk karbohidrat koloid larut air yang terdapat dalam buah atau sayuran matang dan dapat digunakan dalam pembuatan jeli dan jam buah (http://www.cpkelco.com/food/pektin.html 2005). Struktur pektin dapat dilihat pada Gambar 16 (http://www.cpkelco.com/food/pektin.htm2005).
Gambar 16 Struktur kimia pektin
Pektin adalah suatu kelompok heterogen dari struktur asam polisakarida yang terdapat terutama dalam dinding sel dan lamela tengah pada buah dan sayuran. Pektin memiliki struktur kompleks yang terdiri dari homopolimer termetilasi sebagian asam poli-α-(1→4)-D-galakturonat (smooth, Gambar 17) dan terdapat wilayah non-gelling rambuty (Gambar 18) dari perubahan bagian α -(1→2)-L-ramnosil-α-(1→4)-D-galakturonosil yang mengandung branch-points dengan rantai samping netral (1-20 residu) dari L-arabinosa dan D-galaktosa (ramnogalakturonan I). Pektin dapat juga mengandung rantai samping ramnogalakturonan II yang mengandung residu lainnya seperti D-silosa, L-fukosa, asam D-glukuronat, D-apiosa, asam 3-deoksi-D- mano-2-oktulosonat (Kdo) dan asam 3-deoksi-D- likso-2-heptulo sonat (Dha) yang terikat pada daerah asam
Gambar 17 Wilayah smooth homopolimer pektin termetilasi (Chaplin 2004)
Gambar 18 Wilayah non-gelling rambuty pektin (Chaplin 2004)
Pada umumnya, pektin tidak menunjukkan struktur yang pasti. Bentuk residu asam D-galakturonat paling banyak dari molekul, dalam memisahkan daerah ‘smooth’ dan ‘rambuty’ (Chaplin 2004). Campuran enzim dengan sifat khusus yang dapat meningkatkan aktifitas spesifik, dapat dibuat dengan mengkombinasikan masing- masing protein murni atau setiap domain dari organisme yang memproduksinya atau dari rekombinan organisme. Kombinasi tersebut dapat enzim murni yang berasal dari organisme berbeda atau suplementasi enzim kasar dengan enzim murni atau suplementasi enzim murni dengan domain yang mengikat selulosa dari organisme lainnya atau dengan ko-faktor spesifik (Howard et al. 2003).
(http://worhington-biochem.com 2005). Disisi lain produk enzim komersial lainnya mungkin hanya mengandung 1 jenis enzim, terutama jika enzim tersebut diproduksi oleh strain termodifikasi secara genetik atau yang tingkat kemurniannya tinggi. Enzim yang terdapat dalam pektinase campuran meliputi poligalakturonase, pektin metil esterase dan pektin liase. Enzim-enzim pektin tersebut bekerja dengan berbagai cara terhadap pektin (http://www.saps.plantsci.cam.ac.uk/osmoweb/pektinase.htm 2005).
Penggunaan enzim komersial dalam ektraksi vanili segar telah banyak dikembangkan karena mampu meningkatkan rendemen serta mempercepat reaksi pembentukan vanilin. Enzim memiliki fungsi penting sebagai katalisator reaksi biokimia yang mampu mengaktifkan senyawa lain secara spesifik. Seperti katalis lainnya, enzim mampu bekerja dengan menurunkan energi aktivasi sehingga reaksi kimia dapat berlangsung lebih cepat. Dalam hal ini, enzim bergabung dengan reaktan, sedemikian rupa sehingga dihasilkan keadaan transisi yang mempunyai energi bebas lebih rendah dibanding keadaan transisi reaksi tanpa katalisator. Setelah hasil reaksi (produk) terbentuk, enzim dibebaskan kembali ke keadaan semula. Keuntungan enzim dibanding katalis lainnya adalah sifat sterioregio, kemoselektivitas dan spesifisitasnya yang tinggi (Chaplin dan Bucke 1990; Dordick 1991; Tucker 1995; http://wikipedia.org/wiki/Enzyme 2006).
Suatu bagian yang sangat kecil dari suatu molekul besar protein enzim berperan mengkatalisis reaksi. Bagian kecil yang disebut bagian aktif (active site) ini melalui suatu mekanisme khas dan selektif dalam hubungan yang disebut kunci dan anak kunci (lock and key), dapat berikatan dengan substrat. Selain bagian katalitik yang merupakan bagian reaktif karena mengand ung gugus fungsi, bagian sisanya yang besar dari molekul enzim juga dibutuhkan untuk berlangsungnya reaksi katalisis. Dalam hal ini aktifitas enzim ditentukan juga oleh struktur 3 dimensinya (Price dan Steven 1991; Wirahadikusumah, 2001). Interaksi enzim dan substrat yang merupakan hipotesis Daniel Koshland pada tahun 1958 dapat dilihat pada Gambar 19 (http://wikipedia.org/wiki/Enzyme 2006).
samping asam amino yang menyebabkan sisi aktif yang terbentuk menjadi suatu bentuk yang tepat sehingga memudahkan enzim untuk melakukan fungsi katalitiknya. Hanya substrat yang dapat terikat pada enzim dan menginduksi perubahan konformasi enzim yang cocok, yang baik bagi substrat (Price dan Steven 1991; http://wikipedia.org/wiki/Enzyme 2006)
molekul substrat
molekul enzim
Gambar 19 Model induced fit Koshland
Beberapa faktor penting yang mempengaruhi aktifitas enzim antara lain suhu, pH dan keberadaan inhibitor. Reaksi-reaksi yang dikatalisis enzim akan sangat menguntungkan jika dilakukan pada suhu tinggi. Walaupun demikian, enzim bersifat labil dan menjadi inaktif pada suhu yang terlalu tinggi (Tucker 1995). Denaturasi enzim oleh panas adalah akibat dari perubahan ikatan- ikatan non kovalen penstabil konformasi enzim seperti ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, jembatan garam internal dan ikatan disulfida (Price dan Steven 1991). Kondisi suhu selama ekstraksi vanili secara enzimatik menjadi hal penting yang harus diperhatikan. Laju reaksi pembentukan vanilin akan meningkat, jika suhu dinaikan. Namun pengaruhnya terhadap aktifitas enzim dan komponen flavor harus menjadi pertimbangan. Suhu ekstraksi vanili antara 38-490C dapat digunakan, tanpa merusak flavor (Purseglove et al. 1981).
(Chaplin dan Bucke 1990). Apabila pH terlalu rendah maka terlalu banyak ion- ion H+ yang mengelilingi enzim dan kemudian ion- ion H+ akan tertarik pada enzim membentuk ikatan hidrogen. Sedangkan jika pH terlalu tinggi, terlalu banyak ion-ion OH-, maka akan berinteraksi dengan daerah-daeah positif dalam enzim, yang mungkin daerah ini merupakan sisi aktif enzim. Akibat adanya kenyataan bahwa interaksi enzim dengan substrat sangat spesifik, maka terjadinya perubahan bentuk sisi aktif, secara langsung ataupun tidak langsung akan menyebabkan kerja enzim yang tidak tepat. Perubahan ini jika permanen akan mendenaturasi enzim (http://en.wikipedia.org/wiki/Pectinase 2006). Di dalam ekstraksi vanili, tingkat keasaman medium alami yang dihasilkan telah sesuai dengan kondisi pH yang diperlukan enzim-enzim hidrolitik penting. Berbagai penelitian ekstraksi vanili secara enzimatik menggunakan pH sekitar 5 yang merupakan pH alami buah.
BAHAN DAN METODE PENELITIAN
TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mutu dan Keamanan Pangan, SEAFAST Center, Institut Pertanian Bogor (IPB), Laboratorium Kimia Pangan, Departemen Ilmu Teknologi Pangan (ITP), IPB, serta Laboratorium Gizi Masyarakat dan Sumberdaya Keluarga (GMSK), IPB. Adapun lama penelitian berlangsung sekitar 10 bulan dari Oktober 2005 sampai Juli 2006.
BAHAN DAN ALAT Bahan
Bahan baku yang digunakan adalah buah vanili segar dan kering jenis Vanila planifolia ANDREWS yang diperoleh dari Desa Tundagan, Kecamatan Ciniru, Kabupaten Kuningan, Provinsi Jawa Barat. Buah vanili segar merupakan buah vanili hijau berusia buah 7-8 bulan dengan karakteristik seragam yakni warna buah hijau, polong penuh, utuh, tanpa cacat atau pecah, panjang minimum 15 cm dan diameter minimum 10 mm. Sedangkan buah vanili kering merupakan buah yang telah mengalami proses kuring dan termasuk mutu II berdasarkan SNI 01-0010-1990 (BSN 1990), dengan syarat umum buah kering memiliki wangi khas vanili, hitam mengkilat, penuh berisi, berminyak, lentur, bebas kapang dan benda asing. Syarat khusus antara lain buah utuh atau terpotong-potong, ukuran polong utuh minimum 8 cm, ukuran polong terpotong-potong tidak disyaratkan, polong utuh yang pecah dan terpotong tidak disyaratkan, kadar air maksimum 30%bb, kadar vanilin minimum 1.5%bk dan kadar abu maksimum 9%bk. Seluruh buah vanili segar dan kering melalui proses pengeringan beku selama 52 jam. Selanjutnya digiling dan diayak dengan saringan berukuran 32 mesh. Pengemasan dilakukan menggunakan plastik rapat dengan keberadaan silica gel, lalu disimpan dalam freezer hingga percobaan dilakukan. Pada Gambar 20 dapat dilihat buah Vanilla planifolia Andrews segar dan kering yang digunakan dalam penelitian ini.
Nelson (asam molibdat, H2SO4 pekat, Na arsenal), Somogy I (Na2SO4, KNa Tartart, Na2CO3, NaHCO3), Somogy II (Na2SO4, CuSO4), bahan untuk pembuatan buffer sitrat (asam sitrat dan Na-sitrat) serta bahan untuk ekstraksi enzimatik dan optimasi ekstraksi enzimatik yang terdiri dari Celluclast L. (Novo), Viscozyme L. (Novo), β-glukosidase (SIGMA), etanol 95% dan alumunium foil.
(a) (b)
Gambar 20 Buah Vanilla planifolia Andrews segar (a) dan kering (b)
Viscozyme adalah pektinase komersial campuran arabinase, selulase, hemiselulase, silanase dan β-glukanase dari Aspergillusaculeatus dengan aktifitas optimum pada pH 3.3-5.5 dan suhu 25-550C. Viscozyme mengandung 120 FBG/ml dan 32.2 unit aktivitas enzim β-glukosidase (1 unit akan membebaskan 1.0 µmol glukosa dari selobiosa per menit pada pH 4 dan suhu 450C). Sedangkan Celluclast adalah selulase komersial yang memiliki aktifitas selulase dari Trichoderma reesei dengan pH optimum 4.5-6 dan suhu 50-600C. Celluclast menga ndung 840 EGU/ml dan 27.7 unit aktivitas enzim β-glukosidase (1 unit akan membebaskan 1.0 µmol glukosa dari selobiosa per menit pada pH 4 dan suhu 450C). Enzim β-glukosidase komersial berasal dari buah almond dengan pH optimum 5. Adapun unit aktivitas enzim β-glukosidase yang terkandung dalam 1 ml enzim adalah 10 unit (1 unit akan membebaskan 1.0 µmol glukosa dari salisin per menit pada pH 5).
Alat
beam, refrigerator, alat pengeringan beku, alat penyaring vakum, timbangan analitik, cawan alumunium, desikator, oven dan krusibel.
PROSEDUR PENELITIAN
Pada Gambar 21 dapat dilihat bahwa prosedur penelitian terbagi ke dalam 5 tahap yakni; (1) Karakterisasi kimia buah vanili segar dan kering, (2) Penentuan suhu inkubasi optimum enzim β-glukosidase, (3) Ekstraksi enzimatik buah vanili segar; (a) Satu jenis enzim komersial dengan pelarut air dan atau etanol serta (b) Dua atau tiga jenis enzim komersial dengan pelarut etanol, (4) Optimasi ekstraksi enzimatik dan (5) Pengamatan terhadap kadar air, serat pangan, vanilin, glukosa dan padatan terlarut.
Gambar 21 Diagram alir tahapan penelitian Tahap 1:
1.Karakterisasi kimia - Air
- Serat pangan - Vanilin
2.Ekstraksi vanili kering tanpa enzim komersial enzim β-glukosidase Parameter : Vanilin
Tahap 4:
Optimasi ekstraksi enzimatik 1.Penentuan konsentrasi enzim Parameter : Vanilin
2.Penentuan waktu inkubasi enzim Parameter : Vanilin
Tahap 3:
Ekstraksi enzimatik
1.Satu jenis enzim komersial dengan pelarut etanol/air
2.Dua/tiga jenis enzim komersial dengan pelarut etanol
Parameter: Vanilin
Ekstrak Terbaik
