BOGOR
2012
Lampiran 1 Prosedur pembuatan media dan reagen yang digunakan dalam penelitian
Media penapisan isolat penghasil pectinase
Bahan-bahan yang terdiri atas 0,3% Pektin, 0,3% (NH4)2 HPO4, 0,2% KH2PO4, 0,3% K2HPO4, 0,01% MgSO4 dan 1,5% agar-agar bakto ditimbang sesuai kebutuhan dilarutkan dengan akuades dan dihomogenisasi. Media kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 0C selama 15 menit. Setelah cukup dingin, media dituang ke dalam cawan petri.
Pewarna lugol
Sebanyak 5 g KI dilarutkan dalam 330 mL akuades steril, kemudian ditambahkan 3 g Iodin dan dihomogenkan. Larutan disimpan dalam botol gelap dan dihomogenkan kembali setiap kali akan dilakukan uji kualitatif.
Media Kultur Cair Isolat Trichoderma sp.
Bahan-bahan yang terdiri dari 1% Pektin, 0,075% Pepton, 0,05% Yeast 0,14% (NH4)2SO4, 0,2% KH2PO4, 0,03% MgSO4.7H2O, 0,03% CO(NH2)2, 0,03% CaCl2, 0,0005% FeSO4.7H2O, 0,00016% MnSO4.7H2O, 0,00014% ZnSO4.7H2O dan 0,0002% CoCl2 ditimbang sesuai kebutuhan dan dilarutkan dengan akuades lalu dihomogenisasi. Media kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 0C selama 15 menit.
Reagen DNS
Sebanyak 1% NaOH dilarutkan dalam air distilasi, kemudian ditambahkan 1% asam dinitrosalisilat (DNS), dan 18,2% Na K Tartarat (sodium tartarat). Semua bahan dilarutkan dalam air distilasi dan disimpan dalam botol gelap pada suhu 4 0C.
Lampiran 2 Kurva standar asam galakturonat
Kurva standar asam galakturonat dibuat dengan pembuatan larutan standar asam galakturonat dengan berbagai konsentrasi (0-1000 ppm). Sebanyak 0,5 mL asam galakturonat dalam akuades steril dengan berbagai konsentrasi ditambah dengan 1,5 mL reagen DNS pada masing-masing tabung reaksi. Setiap larutan kemudian diinkubasi dalam air mendidih selama 15 menit dan diukur absorbansi pada panjang gelombang 575 nm.
y = 0.0007x - 0.024 R² = 0.9971 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 80 160 240 320 400 480 560 640 720 800 880 960 1040 Abso r ban si ( 57 5 nm )
Lampiran 3 Hasil uji aktivitas pektinase isolat T.066
No. Jam ke- ppm mg/mL UmL-1
1 0 76,714 0,0767 0,1206 2 24 63,143 0,0631 0,0993 3 48 70,286 0,0703 0,1105 4 72 73,857 0,0739 0,1161 5 96 50,286 0,0503 0,0791 6 120 58,143 0,0581 0,0914 7 144 61,000 0,0610 0,0959 8 168 109,571 0,1096 0,1723 9 192 43,857 0,0439 0,0690 10 216 57,429 0,0574 0,0903 11 240 43,857 0,0439 0,0690 12 264 0,000 0,0000 0,0000
Lampiran 4 Analisis komponen teh hitam setelah penambahan pektinase
No. Perlakuan TR (%) TF (%) HPS (%) TLC (%)
1. Pektinase 0,086 Uml-1 5,47 0,54 4,91 1,92
2. Pektinase 0,172 Uml-1 5,96 0,56 5,16 1,97
3. Pektinase 0,258 Uml-1 5,08 0,63 4,72 2,01
Lampiran 5 Skema ekstraksi pelarut dalam menentukan komponen senyawa teh hitam
Parameter TF, TR, HPS dan TLC dihitung berdasarkan nilai absorbansi sebagai berikut :
TF (%) = 4,313 x C
TR (%) = 13,643 (B + D - C) HPS (%) = 13,643 x E
TLC (%) = 10 x A
Black tea, 4 g + boiling water 200 ml
Black Tea Extract (BTE)
BTE, 1 ml + 9 ml water BTE, 25 ml + IBMK, 25 ml
IBMK layer Aqueous layer
IBMK, 1 mL + Eth 45%, 9 mL IBMK, 10 mL + Na2HPO4 2.5% 10 OD 380 nm (B) Aqueous layer, 10 mL + N- butanol 10 mL IBMK 1 mL + Eth 45%, 9 mL Aqueous layer discarded OD 380 nm N butanol layer, 1 mL + Eth 45%, 9 mL Aqueous layer, 1 mL + Eth 45%, 9 mL OD 380 nm OD 380 nm OD, 460 nm (A)
DAFTAR PUSTAKA
Alana A et al. 1999. Pectin lyase production by a Penicillium italicum strain. Appl Environ Microbiol. 55: 1612 – 1616.
Andrianis Y. 2009. Pengolahan teh hitam. www.rumahteh.com [20 Januari 2011].
Angayarkanni J, Muthusamy P, Subbaiyan M, Krishnasamy S. 2002. Improvement of tea leaves fermentation withAspergillus spp. pectinase.
J Biosci Bioeng 94: 299 – 303
Barnet G, Hunter M. 1972. Illustrated Genera of Imperfect Fungi. Cambridge: Burgess Publ Pr.
Bhardwaj V. 2010. Exploitation of microorganism for isolation and screening of pectinase from environment. Di dalam: Making Innovation Work for Society: Linking, Leveraging and Learning. Proceedings of the 8th International Conference Globelics; Malaysia, 1-3 Nov 2010.
Campbell NA, Reece JB, Mitchell LG. 2000. Biologi edisi 5. Lestari R et al., penerjemah; Safitri A, Simarmata L, Hardani H, editor. Jakarta: Erlangga Pr. Terjemahan dari: Biology 5th ed.
Chet I, Viterbo A, Brotman Y. 2006. Plant biocontrol by Trichoderma spp. www.weizman.ac.il/biological_chemistry. [11 Januari 2012].
Dirgantara E. 1994. Efek sari seduhan teh hijau (Camellia sinensis L.) terhadap kadar kolesterol dan trigliserida tikus putih yang diberi diet kuning telur dan sukrosa [skripsi]. Jakarta: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia.
Glazer AN, Nikaido H. 2007. Microbial Biotechnology: Fundamental of Applied Microbiology. Ed ke-2. Cambridge: Cambridge Univ Pr.
Gummadi SN, Panda T. 2003. Purification and biochemical properties of microbial pectinase: Review. Process Biochem 38: 987-996.
Hafezi M, Nasernejad B, Vahabzadeh F. 2006. Optimation of fermentation time for Iranian black tea production. Iran J Chem Chem Eng 25: 39-44.
Harman GE, Howell CR, Viterboy A, Chet I, Lorito M. 2004. Trichoderma
species-opportunistic, avirulent plant symbionts. Nat Review Microbiol 2: 43-56.
Harman GE. 2006. Overview of mechanism and uses of Trichoderma spp.
Harold N, Graham PD. 1992. Green tea composition, consumption and polyphenol chemistry. J Prev Med Hygiene 21:34-50.
Iriani ES, Said EG, Suryani A, Setyadjit. 2005. Pengaruh konsentrasi penambahan pektinase dan kondisi inkubasi terhadap rendemen dan mutu jus mangga kuini (Mangifera odorata G.). J Pascapanen 2: 11-17.
[ISTH] International Subcommission on Trichoderma and Hypocrea Taxonomy. 2012. [16 Februari 2012].
Jayani RS, Saxena S, Gupta R. 2005. Microbial pectinolytic enzymes: review.
Process Biochem 40: 2931-2944
Jayani RS, Shukla SK, Gupta R. 2010. Screening of bacterial strain for polygalacturonase activity: its production by Bacillus sphaericus (MTCC 7542). Enzyme Res Vol. 10
Kashyap DR, Vohra PK, Chopra S, Tewari R. 2001. Application of pectinases in the comercial sector: a review. Biores Tech 77: 215-227.
Khairnar Yet al. 2009. Study of pectinase production in submerged fermentation using different strains of Aspergillus niger. Int J Microbiol Res 1: 13-17. Kim Y, Goodner KL, Park J, Choi J, Talcott ST. 2011. Changes in antioxidant
phytochemical and volatile composition of Camellia sinensis by oxidation during tea fermentation. Food Chem 129: 1331-1342.
Kutateladze Let al. 2009. Selection of microscopic fungi-pectinase producer.
Bull Georg Natl Acad Sci 3:136-141.
Megawati. 1995. Kajian kemampuan produksi pektinase (poligalakturonase) oleh
Aspergillus niger hasil isolasi dari perkebunan cacao [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor
Muchtar H, Ahmad N. 2000. Tea polyphenols: prevention of cancer and optimizing health. Am J Clin Nutr 71: 1698s-1702s.
Murugesan GS, Angayarkanni J, Swaminatha K. 2002. Effect of tea fungal enzymes on the quality of black tea. Food Chem 79: 411-417.
Naidu GSN, Panda T. 1998. Production of pectinolytic enzymes: Review.
Bioprocess Eng 19: 355-361.
Nurbailis. 2007. Karakterisasi mekanisme Trichoderma spp. indigenus rizosfer pisang untuk pengendalian Fusarium Oxysporum f.sp. cubens penyebab penyakit layu fusarium pada tanaman pisang [disertasi]. Padang: Program Pascasarjana, Universitas Andalas.
Obanda M, Owour PO, Mang’oka R, Kavoi MM. 2004. Changes in thearubigin fractions and theaflavin level due to variations in processing conditions and their influence on black tea liquor brightness and total colour. Food Chem
85: 163-173.
Okafor UA, Okochi VI, Shalom NC, Ebuehi OAT, Onygemeokerenta BM. 2010. Pectinolytic activity of wild type filamentous fungi fermentedon Agro- waste. Afr J Microbiol Res 4: 2729-2734.
Phutela U, Dhuna V, Sandhu S, Chadha BS. 2005. Pectinase and polygalacturonase production by a thermophilic Aspergillus fumigatus
isolated from decomposting orange peels. Braz J Mirobiol 36: 63-69.
Pedrolli DB, Monteiro AC, Gomes E, Carmona EC. 2009. Pectin and pectinase: production, characterization, and industrial aplication of microbial pectinolytic enzymes. J Biotechnol 3: 9-18.
[PPTK] Pusat Penelitian Teh dan Kina. 2011. Selera pasar teh dunia secara umum terhadap teh hitam orthodox. www.ritc.co.id. [8 Mei 2011].
Rahmah A. 2008. Pengendalian penyakit layu fusarium pada pisang barangan dan pisang kepok menggunakan Trichoderma harzianum di Pasar Usang Kab. Padang Pariaman [skripsi]. Padang: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Andalas.
Rubinder K, Chadha BS, Singh S, Saini HS. 2002. Amylase hyper production by deregulated mutants of the termophilic fungus Thermomyces lanuginosus. J Ind Microbiol Biotechnol 29: 70-74.
Samuels GJ. 1996. Trichoderma: a review of biology and systematics of the genus. Mycol Res 100: 923-935.
Sharma P et al. 2011. Biocontrol genes from Trichoderma species: a review.
Afr J Biotech 10: 19898-19907.
Sittidilokratna C et al. 2007. Screening of pectinase producing bacteria and their efficiency in biopulping of paper mulberry bark. Sci Asia 33: 131-135. Suhartono MT. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Bogor: IPB.
Sutarmaji A. 1994. Pengaruh sari seduhan teh hijau terhadap kadar glukosa darah tikus normal yang diberi diet glukosa [skripsi]. Jakarta: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia.
Takeo T, Ozawa T. 1976. Photometric analysis and statistical evaluation of black tea infussion. Bull Nat Res Ins 12:125-181.
Tjitrosoepomo G. 1989. Taksonomi Tumbuhan (Spermatophyta). Jogjakarta: UGM Pr.
Tuminah S. 2004. Teh (Camellia sinensis var. assamica) sebagai salah satu sumber antioksidan. Cermin Dunia Kedokteran 144: 52-55
WangLF, Lee JF, Park SO. 2008. Discrimination of teaswith different degrees of fermentation by SPME–GC analysisof the characteristic volatile flavour compounds. Food Chem 109:196-206.
Wang H. 2002. Catechins: The essense of tea.
http://www.ifis.org/library.html#ifis/11609. [22 November 2011].
Xiamen Ltd. 2001. Chemical composition of fresh tea shoot. www.xiamenexpimp.com. [20 Januari 2011]
SIMPULAN
Sembilan dari 44 isolat Trichoderma spp. koleksi BTCC LIPI mampu mendegadasi pektin dengan indeks pektinolitik sebesar 0,65-4,8. Isolat dengan indeks pektinolitik tertinggi (T.066) menghasilkan aktivitas pektinase tertinggi sebesar 0,1723 UmL-1 pada hari ke-7 inkubasi. Enzim ini menghasilkan aktivitas tertinggi pada pH 5 dan suhu 40 0C.
Penambahan enzim pektinase pada fermentasi teh dapat meningkatkan nilai parameter kualitas teh hitam. Nilai Theaflavin (TF) tertinggi yaitu 0,63±0,02% dengan peningkatan sebesar 31,25% dihasilkan setelah penambahan 0,258 UmL-1 pektinase. Peningkatan Total Liquor Colour (TLC) juga terdapat pada perlakuan yang sama yaitu sebesar 12,92%. Nilai Tearubigin (TR) tertinggi yaitu 5,96±1,16% dihasilkan setelah penambahan 0,172 UmL-1 pektinase dengan peningkatan sebesar 16,86%. Perlakuan yang sama juga menghasilkan nilai High Polimerized Substance (HPS) tertinggi yaitu 5,16±1,67% dengan peningkatan sebesar 19,72%.